量子点标记病毒对宿主细胞活性影响研究

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随着纳米技术的发展,多种纳米材料得到了广泛应用。其中,量子点作为一种新型的高效稳定的荧光纳米材料,与传统的荧光材料相比,量子点具有宽而连续的激发峰、窄而对称的发射峰,发射波长可调协,发光强度高、荧光稳定性好、耐光漂泊性好等优点,基于这些优点,过去十年间量子点已被广泛应用于生物医药的各个研究领域。   禽流感是危害养禽业和人类健康的主要疫病之一,在世界各地广泛传播,为了有效地预防和控制病毒性传染疾病的传播,深刻认识病毒感染宿主传播过程机制及宿主应答机制显得尤为重要。病毒入胞途径是病毒侵染宿主细胞的重要环节。研究病毒入胞途径对于认识病毒的感染机制具有重要意义,为认识病毒的致病机制及预防病毒性疾病奠定重要的理论基础。目前研究病毒与宿主细胞相互作用的方法主要是基于分子影像(MolecularImaging),量子点标记技术能对侵染宿主细胞动态过程进行多色标记及长时间示踪,并进一步诠释病毒致病机制,将有望成为研究病毒侵染的重要核心技术之一。然而,量子点标记技术是否影响病毒的入胞途径和侵染能力,目前尚未见报道。此外,量子点标记技术对病毒引发宿主应答的影响有待进一步研究。   流感病毒一般具有严格的宿主特异性,能够在天然宿主上很好地复制和传播。我们采用低致病性禽流感病毒H9N2作为研究对象,以人肺上皮细胞A549作为非敏感宿主细胞模型,以MDCK细胞作为敏感宿主细胞模型,通过对比量子点标记和未标记H9N2对细胞活性的影响,探讨量子点标记对病毒引发宿主细胞应答的影响。为研究病毒的致病机制及预防病毒性疾病奠定重要的理论基础。   近年来,由于纳米金良好的生物相容性、独特的光学性能和易与生物分子结合等特点,使得纳米金探针备受关注。纳米粒子表面等离子共振产生的吸收、散射成为研究的热点,并在生物研究和医学检测领域得到广泛应用。纳米金颗粒的形状、大小及分散性影响着纳米金溶液的颜色及等离子共振吸收峰和散射峰。分散性好的纳米金溶液为酒红色,在510-550nm可见光范围内有吸收峰,而随着团聚程度的增加,纳米金溶液颜色由红色变为蓝色,表面等离子共振吸收峰逐渐红移,共振光散射逐渐红移并增强。基于纳米金这种独特的光学性能,近年来构建了大量纳米金光学生物传感器,实现了核酸、蛋白质、金属离子等生物分子的检测,这些方法拥有检测时间短、操作简便、试验成本低等优点。   朊蛋白(PrP)是可传播性海绵状脑病病原体,能引起一类具有传染性的散发性中枢神经系统变性的朊蛋白病,严重危及人类及动物健康。朊蛋白疾病具有遗传性、传染性、致命性和致病对象广泛等特点,潜伏期长,由于非传染性细胞软蛋白(PrPSC)可作为模板降低其向传染性模式(PrPSC)转化的动力学屏障,即PrPSC的存在能促进PrPC向PrPSC的转化,引发朊蛋白疾病的快速传播,故一旦发病,病情发展迅速,它以脑损害为主,直接危及人类及动物健康。因此,发展一种在出现临床症状之前就能简单、快速、灵敏检测朊蛋白的方法十分必要。   本论文的主要研究工作如下:   (1)我们采用A549人肺上皮细胞为非敏感宿主细胞模型,观察未标记病毒与不同量子点标记病毒对细胞活性的影响。研究“两步法”量子点标记对病毒活性的影响。   (2)我们采用MDCK狗肾细胞为敏感宿主细胞模型,观察未标记病毒与不同量子点标记病毒对细胞活性的影响。研究“两步法”量子点标记对病毒活性的影响。   (3)以二巯基辛酸修饰的纳米金(DHLA-AuNPs)为探针,运用共振光散射法高选择性地检测朊蛋白。以重组朊蛋白(rPrP)为模型,研究朊蛋白诱导的DHLA-AuNPs的聚集。朊蛋白能使二巯基辛酸修饰的纳米金团聚,从而引起粒径增大和共振光散射信号增强,可根据纳米金共振光散射信号的增强,实现朊蛋白的高灵敏、高选择性定量检测,线性范围为0.1~20nmol,并且用于实际样中朊蛋白的检测。透射电镜结果表明,朊蛋白的加入使纳米金沉淀,沉淀中存在纤维,说明DHLA-AuNPs粒子的团聚和加入的朊蛋白的纤维化过程有关。该方法成功应用于实际样中朊蛋白含量的测定。
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