Mphy基因过表达对红曲色素代谢的影响及应用

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光是环境中的主要信号因子、天然能源,可直接影响真菌的成长、生理循环、生殖功能及其各种代谢行为。真菌对光信号感知的核心产物为感光色素等各种光受体。光敏色素是一类以吡咯衍生物为色素分子并对红光和远红光有响应的光受体蛋白。本文首先从红曲霉Monascus ruber C100中,通过与基因组对比分析找到了与植物光敏色素同源的基因序列,以红曲霉M.ruber C100为主要研究对象,初步探究了光敏色素基因对红曲菌形成与发育、以及红曲色素代谢过程的影响,并利用RT-q PCR研究色素合成过程与关键基因的相对表达量,进而解析光敏基因功能。我们通过对光敏色素过表达研究发现光敏色素作为红光传感器,在红光条件下抑制性发育,同时通过红曲的液态发酵和固态发酵发现光敏色素过表达菌株在红光条件下色价提高。主要研究结果如下:(1)光敏色素基因的克隆利用设计的特异性引物,从C100基因组中克隆得到光敏色素基因,经测序结果表明:该基因全长3963bp,比对分析预测该基因共编码1292个氨基酸,共包含6个功能结构域:PAS、GAF、PHY、His KA、HATPPase-C、RRD。构建光敏色素基因过表达载体并通过农杆菌介导转化方式将过表达载体导入红曲霉基因组中,筛选并验证得到一株光敏色素基因过表达菌株OE-Mphy。(2)过表达菌株OE-Mphy生长发育分析在不同培养条件下以不同培养基上培养的过表达菌株OE-Mphy并对其进行表征分析,通过荧光显微镜对过表达菌株OE-Mphy微观分析,结果表明:在不同条件下培养的过表达菌株OE-Mphy的菌丝体形态不同,而且其闭孔鞘中孢子数均低于原始菌株C100,同时菌体内充盈着更多代谢物质,过表达菌株OE-Mphy促进了代谢物质的形成。表明光敏色素基因与红曲霉生长、发育繁殖有关。(3)过表达菌株OE-Mphy发酵产红曲色素分析利用紫外分光光度计(UV-Vis)测定了过表达菌株OE-Mphy在不同条件下固、液态发酵的红曲色素产量,结果表明:黑暗条件和自然光下过表达菌株OE-Mphy在液态发酵第9d的胞内色素红、橙、黄色素产量达到最高;固态发酵中,在红光条件下红曲菌主要次级产物红曲色素代谢加速,发酵第13天色素产量达到最大,且红橙黄色素色价较C100都有显著提高,其中R2、Y1、O1、O2增幅达到60%以上;色素总色价达到6868U/g较C100提高33.3%、较自然光条件下过表达菌株OE-Mphy提高86.2%。利用HPLC测定了过表达菌株OE-Mphy在PDB液态发酵和大米固态发酵红曲色素组分,并发现了在过表达菌株OE-Mphy、敲除菌株W7和原始菌株C100菌株中包含六种主要红曲色素:红曲玉红胺(Monascorubramine,R-1)、红斑红曲胺(Rubropunctamine,R-2)、红曲素(Monascin,Y-1)、安卡红曲素(Ankaflavin,Y-2)、橙红曲玉红素(Monascorubrin,O-1)与红斑红曲素(Rubropunctatin,O-2)和另外两种红色素R-3、R-4,并且经质谱检测R-3、R-4的分子量分别为397D、425D。综上结果表明:光敏色素过表达菌株OE-Mphy在红光光照强度为100Lux,光照时间为12h,黑暗培养12h条件下显著提高了红曲色素的总产量。(4)过表达菌株OE-Mphy基因表达量分析光敏色素基因对色素代谢具有显著作用,因此研究光敏色素基因对色素合成及代谢影响,利用RT-q PCR对4个关键红曲色素基因分析。结果显示,在光照培养为每天12h红光照射、强度为100Lux,黑暗培养12h对红曲霉色素代谢有促进作用,红光条件下能够加快红曲霉红曲色素代谢,相同条件下蓝光起抑制作用。
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