【摘 要】
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由于微生物共培养技术能够获得某些纯培养技术无法获得的目标产物,并能有效提高目的物的产率,现已在食品、工业、农业、医药和环保等领域得到广泛应用。采用药用植物内生菌共培养的方法生产与宿主植物相同或相似的次级代谢产物,对解决中草药资源紧缺问题和保护濒危的野生资源具有重要意义。选取具有较好生物活性的甘草内生真菌RP4与五味子内生细菌WF17作为研究对象,对其进行共培养,采用HPLC法对共培养发酵液成分进行
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金面上项目《乌拉尔甘草内生菌及其活性代谢物研究》（No.:H2015003）；
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由于微生物共培养技术能够获得某些纯培养技术无法获得的目标产物,并能有效提高目的物的产率,现已在食品、工业、农业、医药和环保等领域得到广泛应用。采用药用植物内生菌共培养的方法生产与宿主植物相同或相似的次级代谢产物,对解决中草药资源紧缺问题和保护濒危的野生资源具有重要意义。选取具有较好生物活性的甘草内生真菌RP4与五味子内生细菌WF17作为研究对象,对其进行共培养,采用HPLC法对共培养发酵液成分进行分析;采用UPLC-TQ-MS/MS法初步筛选出共培养的最佳条件;同时,针对共培养发酵液中的活性化合物设计提取分离工艺路线,采用硅胶柱色谱、D101大孔树脂柱色谱和聚酰胺柱色谱法,对其进行分离纯化;采用HPLC法、UPLC-TQ-MS/MS法、TLC法、与核磁共振谱(~1H-NMR和13C-NMR)对各单体化合物进行结构鉴定,主要结果如下:采用HPLC法和UPLC-TQ-MS/MS法检测分析甘草内生真菌RP4与五味子内生细菌WF17共培养发酵液活性成分,结果发现共培养发酵液中含有活性物质原儿茶酸、异甘草素和甘草苷等活性成分。采用琼脂扩散法对RP4和WF17共培养发酵液的抑菌活性进行检测,结果显示,共培养发酵液的抑菌活性较菌株单独培养时显著增强。采用UPLC-TQ-MS/MS法对甘草内生真菌RP4与五味子内生细菌WF17的共培养条件的初步筛选结果:接种量比例为RP4:WF17=5:5（v/v）;接入时间为RP4单独培养10天接入WF17共培养4天;培养方式为RP4与WF17共培养。针对共培养发酵液中的活性代谢物设计提取分离路线,其中异甘草素的分离路线为:采用硅胶柱色谱法对Et2O萃取部位进行分离纯化,同时也分离得到苯甲酸;甘草苷的分离路线为:硅胶柱层析法分离Et OAc萃取部位;原儿茶酸的分离路线为:D101大孔树脂柱色谱法-聚酰胺柱色谱法及硅胶柱色谱法对共培养发酵液进行分离纯化。采用微生物共培养的方法对甘草内生真菌RP4与五味子内生细菌WF17进行培养,结果表明,RP4与WF17共培养的过程中存在相互诱导机制,可以产生与宿主植物相同或相似活性成分,说明甘草内生真菌RP4和五味子内生细菌WF17共培养可应用于工业化生产生物活性物质,能够为开发功能性保健食品或新药提供原料。
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