论文部分内容阅读
【目的】探讨BACE1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用及机制。【方法】（1）体外培养人脐静脉内皮细胞,用不同浓度的ox-LDL在不同时间点处理内皮细胞,以建立ox-LDL诱导的内皮细胞损伤模型。通过观察细胞形态、数量和密度,检测细胞存活率,确定ox-LDL处理内皮细胞的最适浓度和最佳时间。（2）将培养的HUVECs随机分为两组:空白对照组、100μg/mL ox-LDL处理组,通过LDH试剂盒和ROS荧光检测内皮细胞的损伤。通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡和蛋白免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。（3）使用100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时后,采用RT-qPCR法检测BACE1 mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法检测BACE1蛋白的表达水平。（4）为了确定si-BACE1的转染效率,将细胞随机分为三组:对照组（不含si RNA）、NC组（转染si-NC）和si-BACE1组（转染si-BACE1）,采用RT-qPCR法检测BACE1mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法检测BACE1蛋白的表达水平。（5）为探讨BACE1是否在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中发挥作用,将实验分为两组:ox-LDL处理组和ox-LDL+si-BACE1组,采用100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24h,通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞和蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。（6）为探讨BACE1在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用机制,在100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24h的条件下,通过蛋白免疫印迹法检测Jag1、NICD和Hes1蛋白的表达。为了进一步探究BACE1是否通过Notch信号通路调控ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡。将实验分为:ox-LDL处理组和ox-LDL+si-BACE1组,通过蛋白免疫印迹法检测Jag1、NICD和Hes1蛋白的表达。（7）使用100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时,将实验分为Notch信号通路抑制组（DAPT）和溶剂对照组（DMSO）,通过免疫印迹法检测Jag1、NICD和Hes1蛋白的表达。（8）为进一步验证BACE1通过Notch信号通路在ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡中的作用,我们构建了BACE1过表达载体,通过蛋白免疫印迹法检测BACE1蛋白的表达水平;在过表达BACE1的基础上加入Notch信号通路抑制剂（DAPT）后,通过蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达。【结果】（1）用不同浓度（0、50、100、150和200μg/mL）的ox-LDL处理内皮细胞不同时间后（0、6、12、24和48h）,根据镜下观察、CCK8检测细胞存活率以及LDH试剂盒检测细胞损伤程度,确定后续实验采用100μg/mL ox-LDL处理24小时作为ox-LDL诱导内皮细胞损伤模型的最佳处理浓度和时间。（2）100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时,LDH试剂盒和ROS荧光检测结果表明,ox-LDL引起内皮细胞损伤。蛋白免疫印迹法检测结果表明,凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Cyt-C的表达水平明显增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低（P＜0.01）。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测结果显示实验组凋亡细胞明显增多。（3）100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时后,BACE1 mRNA和蛋白的表达水平显著增加（P＜0.01）。（4）转染si-BACE1后,BACE1 mRNA和蛋白的表达水平较对照组显著降低（P＜0.01）。（5）100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时,si-BACE1组的凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Cyt-C的表达水平明显降低,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显升高,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测结果显示实验组凋亡细胞明显减少（P＜0.01）。（6）100μg/mL ox-LDL处理内皮细胞24小时,相较于对照组,实验组中Notch信号通路相关蛋白Jag1、NICD和Hes1的表达水平明显升高,表明ox-LDL处理激活了Notch信号通路。进一步研究发现,与ox-LDL处理组相比,ox-LDL+si-BACE1组Notch信号通路相关蛋白Jag1、NICD和Hes1的表达水平明显降低（P＜0.01）。（7）与对照组相比,Notch信号通路抑制组（DAPT组）Notch信号通路相关蛋白Jag1、NICD和Hes1的表达水平明显降低（P＜0.01）。（8）过表达BACE1后,BACE1的表达水平较对照组显著增加（P＜0.01）。BACE1过表达载体构建成功后,进一步研究发现,与对照组相比,ox-LDL+pGL4.21-BACE1+DAPT组凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3和Cyt-C的表达水平明显降低,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显增加（P＜0.01）。【结论】BACE1通过Notch信号通路促进ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡。