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目的:果蝇dfmr1与人类脆性X智力低下基因1（Fragile X mental retardation gene 1,FMR1）序列高度同源、功能相似,在果蝇不同生长阶段dfmr1表达水平不同且受到mi RNA的调控。本课题组前期研究发现,mir-219在果蝇中可以调控dfmr1的表达,但对果蝇生存能力、表型及行为学的影响并不清楚。因此,本文开展Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇功能的初步研究,阐明Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇生存能力、行为学的变化及体内外mir-219-mRNA调控途径,为进一步揭示其在脆性X综合征（Fragile X syndrome,FXS）的发病机制提供理论依据。方法:1.利用基因重组技术构建pUAST-attB-mir-219重组载体,并通过胚胎显微注射技术构建UAS-mir-219果蝇,分别用Arm-Gal4和Elav-Gal4驱动UAS-mir-219过表达后获得Arm-Gal4＞mir-219和Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇;2.利用幼虫爬行实验、成虫爬壁实验、果蝇攻击实验和交配取向实验研究Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇行为学的变化;3.通过寿命、蛹化率、孵化率、性别比例及异翅比例实验研究不同生长阶段Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇的生长发育状况及果蝇表型的变化;4.采用生物信息学、q RT-PCR和Western Blot实验分别从体内和体外对mir-219-mRNA调控途径进行预测及验证。结果:一.转基因果蝇模型的构建及鉴定:1.PCR扩增得到大小约为815 bp的mir-219前体DNA序列,将其克隆至p UAST-att B空载体中,经测序及Blast比对分析后显示pUAST-att B-mir-219重组载体构建成功;2.PCR扩增转基因果蝇基因组中插入的mir-219前体DNA和部分载体序列,其测序结果经Blast分析后初步表明UAS-mir-219转基因果蝇构建成功;3.q RT-PCR检测Arm-Gal4＞mir-219和ElavGal4＞mir-219果蝇中mir-219表达水平,与野生型果蝇相比,转基因果蝇中mir-219表达水平均增高（P＜0.01,P＜0.001）,进一步说明UASmir-219转基因果蝇构建成功。二.mir-219对果蝇行为学的影响:1.三龄幼虫爬行能力实验显示Elav-Gal4＞mir-219三龄幼虫呈现频繁转向运动,其爬行距离及速度均降低（P＜0.001）;2.成虫爬壁实验表明Elav-Gal4＞mir-219果蝇在第15天以及22天成虫爬壁能力下降（P＜0.05）,而第1天、8天无明显变化（P＞0.05）;3.果蝇攻击行为显示Elav-Gal4＞mir-219果蝇第7天和15天首次发起攻击的时间缩短、攻击频率增强,表明攻击行为增强（P＜0.05）;4.果蝇交配取向实验表明Elav-Gal4＞mir-219果蝇第7天及15天交配取向紊乱、交配频率降低（P＜0.05）。三.Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇表型的变化:1.果蝇蛹化率测定显示Elav-Gal4＞mir-219果蝇在幼虫发育为蛹阶段存在发育异常,且蛹化率显著降低（P＜0.001）;2.果蝇孵化率测定表明ElavGal4＞mir-219果蝇孵化率显著降低（P＜0.001）;3.果蝇寿命试验显示Elav-Gal4＞mir-219雌性果蝇和雄性果蝇寿命均降低（P＜0.001）;4.果蝇性别比例测定显示Elav-Gal4＞mir-219雌性果蝇数目显著降低（P＜0.001）;5.果蝇异翅比例测定显示Elav-Gal4＞mir-219雌蝇存在异翅现象,且异翅比例显著上升（P＜0.001）;6.Western Blot检测表明无论是三龄幼虫还是成虫阶段,Elav-Gal4＞mir-219果蝇均降低d FMRP的蛋白水平（P＜0.001）。四.mir-219-mRNA调控途径的预测及验证:1.利用Target Scan、RNAhybrid和PicTar三个数据库预测dme-mir-219靶基因,并结合GO和KEGG富集分析,初步筛选到4个dme-mir-219候选靶基因,分别为Cip4、para、slo和fra;2.qRT-PCR检测Elav-Gal4＞mir-219果蝇中候选靶基因的表达。结果显示para和slo的mRNA表达上升（P＜0.001,P＜0.01）,Cip4 mRNA表达下降（P＜0.05）,而fra mRNA表达无明显改变（P＞0.05）;当dfmr1表达降低后,para mRNA表达上升（P＜0.01）,slo和Cip4的mRNA表达下降（P＜0.01）,而fra mRNA表达无明显改变（P＞0.05）;3.q RT-PCR检测转染hsa-mi R-219 mimic后SK-N-SH细胞中hsa-mi R-219的表达水平。结果显示,相比对照组,转染后细胞中的hsa-mi R-219表达水平上调（P＜0.001）;Western Blot检测显示在SK-N-SH细胞中,hsa-mi R-219过表达后,SCN1A蛋白表达增加（SCN1A为para的人类同源基因）（P＜0.05）,而对FMRP蛋白表达无明显改变（P＞0.05）;4.Western Blot实验显示在FMR1干扰后的SK-N-SH细胞中,SCN1A蛋白水平无明显改变（P＞0.05）。结论:1.成功构建Elav-Gal4＞mir-219转基因果蝇;2.果蝇体内高表达dme-mir-219可影响其生长发育和表型并导致行为异常;3.果蝇体内dme-mir-219可调控para、slo和Cip4 mRNA的表达;4.SKN-SH细胞内hsa-mi R-219可调控SCN1A的表达。