次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)是嘌呤核苷酸挽救合成途径的一个关键酶。HPRT的缺失会导致人的Lesch-Nyhan综合症和痛风性关节炎等遗传病；并且由于到目前所有研究过的寄生虫的嘌呤核苷酸的合成只有挽救途径，而HPRT作为多种寄生虫嘌呤核苷酸挽救合成途径中的关键基因也是抗寄生虫药物设计的潜在靶标。鉴于这些原因，在医学上，人、其它哺乳动物、细菌及寄生虫HPRT一直备受关注。比较而言，植物嘌呤挽救合成途径的研究还很有限，而对植物HPRT的分子研究还未见报道。作为双子叶模式植物，拟南芥的全基因组测序结果揭示其基因组中存在一个编码HPRT的基因。　　 本博士论文研究目的就是要进一步了解模式植物拟南芥的HPRT的基本结构、表达模式、生化及生理功能。　　 利用公共数据库中全长cDNA及EST等序列信息，我们成功地分离了拟南芥、大豆及小麦的HPRT全长编码区的cDNA。它们分别编码188、185和186个氨基酸的蛋白。植物HPRT与其它生物的HPRT推导的氨基酸序列比较的结果显示：植物HPRT在氨基酸序列上均具有PRT家族蛋白典型的保守区以及与HPRT的底物结合和催化活性密切相关的保守的氨基酸残基。系统发生分析表明，植物HPRT聚成一个独立的分支，并且，双子叶植物拟南芥和大豆聚成小的分支，而单子叶植物水稻和小麦聚在一起。比较而言，植物的HPRT与细菌HPRT的亲缘关系更近。拟南芥HPRT(AtHPRT)的表达模式分析显示，AtHPRT在拟南芥中是组成型表达的，但在根、叶子、花和花蕾中的表达水平较高，在茎和果荚中的表达量稍低。　　 利用酵母互补试验初步验证了三种植物HPRT均具有挽救鸟嘌呤的能力。在此基础上，我们在裂殖酵母中大量表达了AtHPRT，并对纯化的均一蛋白进行了生化分析。结果表明，AtHPRT能够催化可逆反应。在正反应中，AtHPRT对鸟嘌呤和PRPP的亲和力很高(Km=28.6μM和Km=31.3μM)，对次黄嘌呤的亲和力较低(Km=175.6μM)，而对黄嘌呤几乎检测不到明显的催化反应发生。在逆反应中，AtHPRT对GMP和IMP表现出很高亲和力(Km=50.55μM， Km=26.6μM)，但对PPi的亲和力则异常的低(Km=330.65μM)，比PRPP的低10倍左右。由此推测，AtHPRT可能与寄生虫G.lamblia GPRT的生化功能相似，在植物体内主要负责挽救鸟嘌呤合成鸟核苷酸。　　 基于动力学分析的结果，我们对AtHPRT上的PPi结合区很感兴趣。根据氨基酸序列比较推测植物HPRT的PPi结合区为ATGA46-49。在此位点，AtHPRT与寄生虫G.lamblia GPRT相近(LTGA)而与人HPRT差别很大(LKGG)。为了鉴定植物HPRT的“PPi-binding loop”并且了解该位点上氨基酸组成与功能的关系，我们构建、表达并纯化了A46L/T47K和A49S两个突变体蛋白。生化分析显示，A49S的底物专一性和动力学参数与野生型的并没有显著的差异，这表明ATGA46-49中的A49用相似氨基酸残基替代后并不改变AtHPRT动力学特性。然而，A46L/T47K表现出了明显不同于野生型AtHPRT生化特性。其中最为显著的改变是， A46L/T47K对PPi的亲和力提高为野生型的3倍(Km=121μM)，同时，A46L/T47K对GMP和IMP的亲和力较野生型AtHPRT也有所提高(Km=33.6μM和Km=17.5μM)，而对鸟嘌呤和次黄嘌呤的亲和力有所降低(Km=63.5μM和Km=222.8μM)。这些数据说明，ATGA46-49与AtHPRT的焦磷酸催化活性及其逆反应催化效率密切相关。这一位点是植物HPRT的“PPi-binding loop”。　　 在体外生化功能研究的基础上，我们又进一步分析了拟南芥种子萌发及叶片发育和衰老两个重要过程中的AtHPRT表达情况。AtHPRT的转录水平在拟南芥种子萌发的整个过程受到严格的动态调控，其表达在第五天呈现出一个明显的高峰期，到第七天后又逐渐降低到初始水平。AtHPRT在叶片的整个发育和衰老过程中持续表达，并且随着叶片的成熟其表达增强；而在叶片衰老过程中，AtHPRT的表达逐渐降低。基于这些结果，我们推测，AtHPRT可能在种子萌发早期的嘌呤核苷酸的合成中扮演了重要的角色，而在种子萌发后期，由于从头合成途径的参与，AtHPRT的挽救能力逐渐减弱。另外，在叶片快速发育过程中，AtHPRT可能对于维持较高水平的嘌呤核苷酸池发挥了重要的作用。然而，在叶片衰老过程中，我们对AtHPRT的功能的理解还很有限。衰老叶片中的核酸降解产生的嘌呤可能被直接转运或经氧化生成酰脲后再被转运到其他的器官。　　 为了获得体内AtHPRT功能的分子遗传证据，我们构建并鉴定了T-DNA(AtHPRT1-1)插入突变体和过量表达AtHPRT的转基因突变体。在正常生长条件下，过量表达及T-DNA突变体在种子萌发和植株生长过程中与野生型没有明显的差异。然而，当存在8-azaguanine(一种细胞毒性的鸟嘌呤类似物)时，T-DNA突变体的萌发和生长受到抑制的程度明显比过量表达和野生型轻。这表明，AtHPRT在植物体内具有酶活性，但该其功能的缺失并不会影响拟南芥植株的发育和形态，这可能由于其它挽救分支如APRT以及植物特有的嘌呤氧化降解系统的存在。