【摘 要】
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菘蓝（Isatis indigotica Fort.）是十字花科（Cruciferae）菘蓝属（Isatis）两年生草本植物,也是大宗中药板蓝根和大青叶的源植物,主要含有生物碱类、苯丙素类、有机酸类、黄酮类和芥子油苷类等众多化学成分,具有抗菌、抗病毒、增强免疫及抗肿瘤的药理作用。其中,芥子油苷类化合物因在植物防卫反应和抗癌中的作用受到广泛关注,目前在拟南芥等物种中证实了 MYB类转录因子对芥子油苷
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菘蓝（Isatis indigotica Fort.）是十字花科（Cruciferae）菘蓝属（Isatis）两年生草本植物,也是大宗中药板蓝根和大青叶的源植物,主要含有生物碱类、苯丙素类、有机酸类、黄酮类和芥子油苷类等众多化学成分,具有抗菌、抗病毒、增强免疫及抗肿瘤的药理作用。其中,芥子油苷类化合物因在植物防卫反应和抗癌中的作用受到广泛关注,目前在拟南芥等物种中证实了 MYB类转录因子对芥子油苷的合成与积累具有重要的调控作用,且转录因子MYB28和MYB29参与脂肪族芥子油苷的合成积累过程,但菘蓝中缺乏相关研究报道。本研究基于实验室前期研究结果,对转IiMYB28-1拟南芥进行了表型观察、芥子油苷含量测定和基因表达研究等;克隆IiMYB29基因,并进行生物信息学分析、表达模式分析及功能初探,相关结果为阐明IiMYB28-1和IiMYB29在芥子油苷合成中的调控机理提供了实验依据,也为培育芥子油苷含量升高的菘蓝优质新品种提供了思路。本论文获得的主要研究结果如下:（1）基于前期研究结果,对8个转IiMYB28-1拟南芥株系（OE1～OE8）进行检测,选择IiMYB28-1基因表达量最高的OE2株系进行表型观察,结果显示,IiMYB28-1过表达植株提前进入生殖生长阶段、植株矮小、莲座叶面积较小、莲座叶数量在营养生长早期较少而后期显著增加、主茎细且数量增加,提示IiMYB28-1可能参与植物的生长发育过程。（2）利用HPLC技术对OE1～OE8株系中7种芥子油苷的含量进行了测定,结果显示,4种脂肪族芥子油苷中,4MSOB的含量增加最多,达到对照的1.38～6.87倍;3MSOP的积累较为明显,为对照的1.54～3.83倍;而4MTB和8MSOO的含量变化存在一定的波动,其中OE2株系中二者含量仅为对照的0.10和0.36倍。对吲哚族芥子油苷而言,IiMYB28-1明显地促进了 I3M、1MOI3M和4MOI3M的含量积累。（3）采用qRT-PCR方法,检测OE2株系中芥子油苷合成通路相关酶基因的表达。结果显示,MAM3和CYP79B3的表达显著降低,分别为对照的0.19和0.56倍;MAM1、CYP79F1和CYP79F2与对照相比无显著性差异;GSL-OH表达量显著上升,达到对照的1.82倍,相关研究结果提示IiMYB28-1可能负调控长链脂肪族和吲哚族芥子油苷的侧链延伸过程,正向调控脂肪族芥子油苷侧链修饰过程。（4）采用RNA-seq技术研究OE2株系中的基因表达情况,共产生25.92 Gb的Clean Data,检测到27.406条基因,筛选获得差异表达基因（DEGs）223条,包括上调基因148条和下调基因75条。DEGs主要涉及细胞过程、单组织过程、运输催化过程、转运和代谢过程等。芥子油苷生物合成途径富集到7个DEGs,且富集显著性最可靠。（5）酵母单杂交结果初步证实了 IiMYB28-1与IiMAM1.3、IiGSL-OH2、IiGSL-OH3、IiCYP83B1和IiCYP81F2基因间存在互作关系,与IiMAM1.1、ILAOP2、IiGSL-OH1、IiMAM1.2、IiCYP79F1、IiCYP83A1、IiCYP79B2 和 IiCYP79B3之间无互作关系,进一步表明IiMYB28-1可能通过参与脂肪族芥子油苷侧链延伸和修饰,以及吲哚族芥子油苷核心结构形成和侧链修饰过程,从而在脂肪族和吲哚族芥子油苷的生物合成过程中发挥作用。（6）菘蓝IiMYB29基因（GenBank登录号:MH744538）的基因组DNA全长为1496 bp,包含3个外显子和2个内含子;ORF全长1044 bp,编码347个氨基酸;蛋白二级结构中无规则卷曲所占比例最高（51.87%）,与三级结构预测结果一致;存在2个典型MYB DNA-binding保守结构域,属R2R3-MYB类蛋白。亚细胞定位结果表明,IiMYB29蛋白主要定位于细胞核中。（7）对IiMYB29在菘蓝不同组织部位和发育时期的表达模式进行分析,结果显示IiMYB29在成熟叶、幼叶、成熟茎和主根中表达量高,且在种子萌发120 d和150 d的表达水平较高,IiMYB29基因表达具有时空特异性,可能在菘蓝营养器官,以及生长发育过程中发挥重要作用。（8）IiMYB29与IiMAM1.3、IiGSL-OH1、IiGSL-OH2和IiCYP81F2基因间存在互作关系,与IiGSL-OH3、IiCYP79B2、IiCYP83B1、IiMAM1.1、IiMAM1.2、IiCYP 79F1、IiCYP83A1、IiAOP2和IiCYP79B3之间未显示互作关系,推测IiMYB29通过参与脂肪族芥子油苷侧链延伸和修饰过程,以及吲哚族芥子油苷侧链修饰过程,对两类芥子油苷的合成与积累产生影响。
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