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噪声诱发的听力损失（Noise-induced hearing loss,NIHL）是除老年性聋外最常见的非遗传性感音神经性耳聋（sensorineural hearing loss,SNHL）的最常见形式之一,并且随着工业化社会的发展,其发病率逐年上升,在现代生活中给个人的日常交流和身心健康带来沉重的负担。据2020年WHO数据显示,全世界超过3.6亿人受到噪声性耳聋困扰,美国疾病控制中心（Centers for Disease Control,CDC）近期统计了 70岁以下美国成年人群听力障碍情况,约有近2600万人患有噪声诱发的听力损失（Noise Induced Hearing Loss,NIHL）,患病率达 15%,12 岁以上的有听力障碍的美国青少年人群中有超过16%是由于过度噪声暴露导致。幼儿与老年人的听力障碍还呈现容易发生自闭和抑郁的趋势。噪声性听力损伤严重威胁人民健康,是关系到我国社会经济长远发展的重要医学研究领域。与传导性听力损失不同,对于感音神经性听力损失,例如噪声和耳毒性药物引起的听力损失,或老年性耳聋,因机制不清,缺乏有效药物用于临床治疗。以往研究发现长期噪声暴露可损伤耳蜗螺旋神经节细胞,但其嘌呤能受体蛋白表达情况不明确,亟需开展针对螺旋神经节细胞嘌呤能受体鉴定与表达调控的研究。嘌呤能信号分子在耳蜗机制中的作用已被证实,包括在耳蜗个体发育过程中建立突触传递,在Corti器官的支持细胞中发出噪声损伤的信号,以及在声传导的基础上调节电化学稳态。ATP是细胞外信号分子,几乎参与发育,病理生理,神经传递和神经调节的各个方面。以ATP最终裂解产物腺苷酸为配体的受体称为P1嘌呤受体（简称P1）;以ATP及其类似物为配体的受体,称为P2嘌呤受体（简称P2）,其在体内分布广泛,是主要的嘌呤能信号。P2受体包括两个家族:离子型P2X和G蛋白偶联的P2Y受体,P2X受体（代表ATP门控离子通道）被细分为七个亚型（P2X1至P2X7）;P2Y受体包含至少八个亚型（P2Y1,P2Y2,P2Y4,P2Y6,P2Y11,P2Y12,P2Y13和P2Y14）。在听觉系统发育开始之前,螺旋神经节细胞（Spiral Ganglion Neurons,SGNs）表现出自发活动,这与大脑中的中枢听觉通路建立了突触传递,而嘌呤能信号机制是这一过程的基础。暴露于噪声后,可检测到ATP受体蛋白表达的上调和下调,这表明P2受体可能参与噪声损伤并受噪声调控。由于新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019,COVID-19）原因,国外部分抗体无法订购或缺货,所以本次研究P2蛋白的种类仅限于P2X2、P2X3、P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4。本研究新颖之处在于采用单离SGNs染色进行形态学研究,采用中高强度白噪声长时间刺激耳蜗建立噪声性耳聋动物模型,观察P2受体在耳蜗SGNs中的定位、表达及变化,从而探索SGNs嘌呤受体表达调控与噪声性听力损失的关系,为明确SNHL治疗靶点提供理论依据。第一部分正常豚鼠耳蜗SGNs中P2受体表达形态研究目的:创新单离SGNs形态学研究的实验方法,明确观察P2受体蛋白在正常豚鼠耳蜗SGNs中的表达情况,为形态学研究提供更加直观可靠的实验技术,并为进一步研究P2受体在听觉损伤过程中的作用奠定基础。方法:选取200-250g的成年豚鼠10只,取材前均进行听性脑干反应（Auditory brainstem response,ABR）测定,然后进行冰冻切片及单离细胞的免疫荧光染色,采用NF-200标记SGNs,使用共聚焦显微镜成像观察P2蛋白表达。结果:结合冰冻切片及单离细胞染色结果显示,P2X2、P2X3、P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4均在SGNs中表达,并且均表达在细胞内,而单离细胞染色与冰冻切片相比,其抗原性更强,形态观察更清楚明了。其中P2X2、P2Y2、P2Y4 在 SGNs 中表达较强,而 P2X3、P2X4、P2X7 表达较弱。结论:本研究首次发现ATP受体亚型P2X2、P2X3、P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4在豚鼠SGNs中表达,即P2受体的表达不仅于豚鼠耳蜗感觉细胞及支持细胞中,还表达于神经细胞中。而研究中所采用的单离SGNs观察及染色作为一种新颖的观察形态学的研究技术,避免了组织遮蔽,可以更加清晰的直接观察P2受体在SGNs中的表达部位,结合冰冻切片可以对所观察组织进行定位,为下一步关于研究噪声损伤后P2受体在SGNs中表达变化提供理论依据及实验基础。第二部分噪声损伤影响豚鼠耳蜗SGNs中P2受体表达的形态研究目的:明确豚鼠噪声暴露后P2受体在耳蜗SGNs中的表达变化,探讨螺旋神经节细胞P2受体变化与噪声性听力损失的关系。方法:ABR筛选正常听力健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠10只,予以白噪声（120 dB SPL,每天3小时,连续10天）暴露,在开始噪声暴露第7天、第10天行ABR测听,噪声暴露结束后取材。然后进行冰冻切片及单离细胞的免疫荧光染色,采用NF-200标记SGNs,使用共聚焦显微镜成像观察P2受体表达。结果:荧光结果显示,噪声暴露后SGNs中P2X2、P2X3表达增强,而P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4表达下调,其中P2X3表达增强及P2X4、P2Y2表达下调具有统计学意义（P＜0.05）。结论:120 dB SPL白噪声暴露前后SGNs中P2受体表达发生上调（P2X3）或下调（P2X4、P2Y2）,推测SGNs中嘌呤能受体变化可能影响Ca2+平衡来降低噪声刺激后听觉的敏感性,从而达到NIHL的防治作用。第三部分噪声损伤前后豚鼠耳蜗SGNs中P2受体表达差异的验证目的:在蛋白质及RNA层面确定噪声暴露前后豚鼠耳蜗SGNs中P2受体表达差异,进一步验证形态学研究结果。方法:ABR筛选正常听力健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠20只,予以白噪声（120 dB SPL,每天3小时,连续10天）暴露,在开始噪声暴露第7天、第10天行ABR测听,噪声暴露结束后取材。进行Western blot及荧光实时定量PCR检测,噪声暴露前后耳蜗SGNs中P2受体表达差异通过分析灰度值及2-△△CT值。结果:噪声暴露前后豚鼠耳蜗SGNs中均有P2X2、P2X3、P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4等受体蛋白的表达,噪声暴露后与噪声暴露前相比P2受体在SGNs中的表达出现上调或下调。P2X3在噪声暴露后表达量较噪声暴露前明显上调（P＜0.05）,P2X4、P2Y2在噪声暴露后表达量与噪声暴露前相比明显下调（P＜0.05）。荧光实时定量PCR检测正常组、噪声组豚鼠耳蜗SGNs的mRNA水平,P2X2、P2X3、P2X4、P2X7、P2Y2、P2Y4 的 mRNA 水平变化趋势与蛋白质表达趋势具有一致性,其中P2X7、P2Y2、P2Y4的mRNA水平变化具有显著性差异（P＜0.05）。结论:通过Western blot、荧光实时定量PCR研究,噪声暴露后P2X3表达发生上调,P2X4、P2Y2下调,与细胞免疫荧光染色结果一致,进一步的表明P2受体在噪声引起的听力损失中扮演着重要的角色,可为探寻SNHL的治疗靶点提供理论依据。