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研究背景：
癫痫持续状态(status epilepticus，SE)是神经科常见危重症，具有高发病率与致死率的特点。脑水肿及其导致的颅高压、甚至脑疝是SE患者早期死亡的主要原因。癫痫持续发作可引起血脑屏障(blood brain baHier，BBB)的破坏及血管源性脑水肿，而BBB破坏可进一步恶化癫痫发作。脑水肿是加重癫痫发作及影响SE预后的重要因素。
脑水肿的形成按以下三个事件顺序发生：细胞毒性水肿、血脑屏障破坏、血管源性水肿。细胞毒性水肿被认为是引起严重脑水肿的起始及至关重要的步骤，阻断细胞毒性水肿的发生可避免其后更为严重的血管源性水肿的发生。磺脲受体1调控的瞬时受体电位M4(sulfonylurea receptor1-reguIated transient receptor potential M4，SUR1-TRPM4)通道的开放可引起Na+及水的内流，并导致细胞毒性水肿的发生。SURl受体阻滞剂格列本脲(glibenclamide，GBC)通过抑制SUR1-TRPM4通道的活性，己被证实在脑梗死、脑出血、脑外伤、肝性脑病的动物模型中具有减轻脑水肿及神经保护作用。同时在心肺复苏大鼠模型中，也可明显改善神经功能预后，其作用甚至可与目标低温治疗相媲美。但GBC是否可以减轻SE诱导的脑水肿及改善SE的预后尚未有报道。
研究目的：
探讨GBC是否可以减轻大鼠SE模型的脑水肿及改善预后。
研究方法：
一、大鼠SE诱导的脑水肿模型的建立
本研究采用锂.匹鲁卡品联合诱导SE的方法造模。大鼠SE造模成功后，随机分为SE1.5h组(n=15)、SE2h组(n=15)、SE2.5h组(n=25)、SE3h组(n=20)。所有大鼠统计3天生存率和评估脑水肿、神经损伤及神经炎症反应(SE3h组因3天死亡率太高，未留脑组织标本行组织学检查)。①干湿重法评估不同组别大鼠大脑半球、海马及梨状皮质的脑含水量;②Nissl染色观察不同组别海马cAl区及梨状皮质区神经元坏死情况，IgG、Ibal、GFAP免疫组化法分别观察BBB破坏、小胶质细胞及星型胶质细胞活化情况。
二、格列本脲在大鼠SE诱导的脑水肿模型中的脑保护作用及其机制研究
SE造模组大鼠在癫痫持续发作2.5h后，随机分配到GBC组及溶媒对照(Vehicle)组。GBC组大鼠予首剂10μg/l(g负荷剂量GBC腹腔注射，然后1.2μg/6h，一共3天，Vehicle组大鼠予相同剂量的DMSO与生理盐水腹腔注射。
本研究包括四个部分。第一部分，Vehicle组(n=36)、GBC组(n=23)以及空白对照(Non-SE)组(n=10)的大鼠连续观察28天生存率及神经功能预后以及评估病理学损伤。从SE第8天至第28天，24小时不问断监测SE大鼠自发复发性癫痫(Spontaneous recuHent seizures，SRS)发作情况，统计每天发作频率、每次发作持续时间及发作级别。在SE后第28天，行水迷宫检测各组别大鼠学习记忆功能。水迷宫试验完成后，尼氏染色观察大鼠海马CA1区及梨状皮质区神经元存活的数目、Iba1免疫组化观察小胶质细胞活化。第二部分：评估SE3天后不同组别大鼠脑水肿、神经损伤、神经炎症、SUR1及TI冲M4的表达情况(均n=5)。①干湿重法评估不同组别大鼠大脑半球、海马、梨状皮质的脑含水量;②Nissl染色观察海马CA1区及梨状皮质区神经元坏死情况，免疫组化法观察神经元树突损伤(MAP2)、BBB破坏(内源性IgG)、小胶质细胞活化(Iba1)情况，组织免疫荧光法检测SUR1和TRPM4在海马CA1区与梨状皮质区的阳性细胞数，及SUR1与TRPM4、NueN、vWF是否有共定位;③分别提取不同组别的大鼠海马与梨状皮质的蛋白，Westem blotting法检测SUR1、TRPM4、COX2及IL-6表达水平。第三部分，利用荧光定量PCR法及Westem blotting法检测SE后6h、12h、24h、3d、7d海马区及梨状皮质区SURl与TRPM4的表达情况(均n=5)。第四部分，侧脑室注射Trpm4siRNA或假肽siRNA，Westem blotting检测海马区TRPM4的表达(分别n=5)，Nissl染色观察神经元坏死情况，免疫组化法检测内源性IgG渗漏情况(分别n=5)。
研究结果：
一、氯化锂-匹鲁卡品诱导的sE持续发作2.5小时可引起明显脑水肿、神经损伤、炎症反应以及适当的3天死亡率。
在脑含水量方面，与Non-SE组比较，SE1.5h组大脑半球、海马及梨状皮质区均无明显变化，而SE2h、SE2.5h及SE3h组相应区域脑含水量均明显升高(均P＜0.05)。在BBB破坏方面，SE1.5h、SE2h及SE2.5h组海马区及梨状皮质区均可见IgG颗粒渗漏，SE2.5h组海马区及梨状皮质区IgG颗粒渗漏明显高于SE2h组(分别P＜0.001，P＜0.05)。在神经损伤方面，SE1.5h组海马CA1区与梨状皮质区神经元坏死情况不明显，而SE2h组及SE2.5h组神经元明显坏死，且SE2.5h组较SE2h组严重(分别P＜0.05，P＜0.01)。在神经炎症方面，SE后活化的小胶质细胞与星型胶质细胞数量明显增多。SE2.5h组的小胶质细胞及星型胶质细胞活化情况比SE2h组更明显。在3天生存率方面，Non-SE组为100％(10/10)，SE1.5h组为93.33％(14/15);SE2h组为73.33％(11/15)，SE2.5h组为40％(10/25)。SE3h组(n=20)大鼠的3天累积生存率极低，仅为20％(3/15)。SE1.5h与SE2h组3天生存率与Non-SE组比较，差异无统计学意义(分别P=0.41，P=0.08)，而SE2.5h及SE3h组3天生存率明显低于Non-SE组(分别P＜0.01，P＜0.001)。
二、GBC减轻SE后脑水肿、神经损伤、小胶质细胞活化，抑制SUR1-TRPM4过表达及改善预后。
在脑水肿方面，与Vehicle组大鼠相应脑区比较，GBC组大鼠大脑半球、海马及梨状皮质区脑含水量均明显减少(均P＜0.05);海马CA1区与梨状皮质区IgG渗漏均明显减轻(均P＜0.001)，梨状皮质区IgG渗漏面积也明显减少(P＜0.01)。在神经损伤方面，格列本脲治疗后大鼠海马CA1区及梨状皮质区神经元坏死较Vehicle组明显改善(P＜0.05)，同时海马CA1区树突丢失也明显减轻(P=0.001)。SE28天后GBC组神经元坏死仍较Vehicle组明显改善(分别P＜0.01，P＜0.05)。在神经炎症方面，GBC组大鼠海马CA1区与梨状皮质区小胶质细胞活化情况较Vehicle组明显减轻(分别P＜0.01，P＜0.05)，COX2、IL-6表达也明显减少(分别P＜0.05，P＜0.01)。SE28天后GBC组小胶质细胞活化情况仍较Vehicle组明显减轻(分别P＜0.01，P＜0.001)。在神经功能预后方面，GBC组大鼠SRS发作频率及每次发作持续时间均较Vehicle组明显减少，SRS发生率及发作级别也有下降趋势。水迷宫结果显示，在获得性记忆训练阶段，GBC组大鼠找到平台时间明显少于溶媒对照组，在第4天两组间差异有统计学意义。在第5天的探索实验中，GBC组大鼠平台穿越次数及在平台象限停留时间均明显高于Vehicle组(均P＜0.05)。在28天生存率方面，Vehicle组大鼠生存率为22.22％(8/36)，而GBC组为47.83％(11/23)，GBC组大鼠28天生存率明显高于Vehicle组(x，2=3.877，P=0.045)。在机制探讨方面，SE6小时后海马区及梨状皮质区SUR1、TRPM4在mRNA与蛋白水平均明显升高，SUR1、TRPM4的mRNA水平升高至少持续3天，而蛋白水平升高至少可持续7天。SURl在SE大鼠脑组织的血管内皮细胞及神经元细胞高表达，且与TRPM4共定位。GBC治疗可减少SE3天后海马区及梨状皮质区SURl与TRPM4的过表达(P＜0.01)。另外，使用Trpm4siRNA敲低SE大鼠脑组织TRPM4过表达后，血脑屏障破坏及神经元坏死同样得到改善。GBC在SE大鼠模型中的脑保护作用与抑制SUR1-TRPM4的过表达有关。
研究结论：
一、癫痫持续状态持续发作2.5小时可引起明显的脑水肿、血脑屏障破坏、神经损害及神经炎症。
二、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的脑水肿及血脑屏障破坏。
三、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的海马CA1区及梨状皮质区神经损伤。
四、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的神经炎症。
五、小剂量的格列本脲治疗提高癫痫持续状态后28天生存率，并减少自发复发性癫痫的发作及改善学习记忆功能。
六、癫痫持续状态诱导SUR1-TRPM4通道过表达。格列本脲治疗可部分抑制SUR1-TRPM4过表达。敲低癫痫持续状态大鼠脑组织TRPM4的过表达后，可以得到类似于格列本脲治疗的减轻脑水肿及神经元坏死的结果。格列本脲在癫痫持续状态中的脑保护作用与抑制SUR1-TRPM4通道的过度表达有关。
癫痫持续状态(status epilepticus，SE)是神经科常见危重症，具有高发病率与致死率的特点。脑水肿及其导致的颅高压、甚至脑疝是SE患者早期死亡的主要原因。癫痫持续发作可引起血脑屏障(blood brain baHier，BBB)的破坏及血管源性脑水肿，而BBB破坏可进一步恶化癫痫发作。脑水肿是加重癫痫发作及影响SE预后的重要因素。
脑水肿的形成按以下三个事件顺序发生：细胞毒性水肿、血脑屏障破坏、血管源性水肿。细胞毒性水肿被认为是引起严重脑水肿的起始及至关重要的步骤，阻断细胞毒性水肿的发生可避免其后更为严重的血管源性水肿的发生。磺脲受体1调控的瞬时受体电位M4(sulfonylurea receptor1-reguIated transient receptor potential M4，SUR1-TRPM4)通道的开放可引起Na+及水的内流，并导致细胞毒性水肿的发生。SURl受体阻滞剂格列本脲(glibenclamide，GBC)通过抑制SUR1-TRPM4通道的活性，己被证实在脑梗死、脑出血、脑外伤、肝性脑病的动物模型中具有减轻脑水肿及神经保护作用。同时在心肺复苏大鼠模型中，也可明显改善神经功能预后，其作用甚至可与目标低温治疗相媲美。但GBC是否可以减轻SE诱导的脑水肿及改善SE的预后尚未有报道。
研究目的：
探讨GBC是否可以减轻大鼠SE模型的脑水肿及改善预后。
研究方法：
一、大鼠SE诱导的脑水肿模型的建立
本研究采用锂.匹鲁卡品联合诱导SE的方法造模。大鼠SE造模成功后，随机分为SE1.5h组(n=15)、SE2h组(n=15)、SE2.5h组(n=25)、SE3h组(n=20)。所有大鼠统计3天生存率和评估脑水肿、神经损伤及神经炎症反应(SE3h组因3天死亡率太高，未留脑组织标本行组织学检查)。①干湿重法评估不同组别大鼠大脑半球、海马及梨状皮质的脑含水量;②Nissl染色观察不同组别海马cAl区及梨状皮质区神经元坏死情况，IgG、Ibal、GFAP免疫组化法分别观察BBB破坏、小胶质细胞及星型胶质细胞活化情况。
二、格列本脲在大鼠SE诱导的脑水肿模型中的脑保护作用及其机制研究
SE造模组大鼠在癫痫持续发作2.5h后，随机分配到GBC组及溶媒对照(Vehicle)组。GBC组大鼠予首剂10μg/l(g负荷剂量GBC腹腔注射，然后1.2μg/6h，一共3天，Vehicle组大鼠予相同剂量的DMSO与生理盐水腹腔注射。
本研究包括四个部分。第一部分，Vehicle组(n=36)、GBC组(n=23)以及空白对照(Non-SE)组(n=10)的大鼠连续观察28天生存率及神经功能预后以及评估病理学损伤。从SE第8天至第28天，24小时不问断监测SE大鼠自发复发性癫痫(Spontaneous recuHent seizures，SRS)发作情况，统计每天发作频率、每次发作持续时间及发作级别。在SE后第28天，行水迷宫检测各组别大鼠学习记忆功能。水迷宫试验完成后，尼氏染色观察大鼠海马CA1区及梨状皮质区神经元存活的数目、Iba1免疫组化观察小胶质细胞活化。第二部分：评估SE3天后不同组别大鼠脑水肿、神经损伤、神经炎症、SUR1及TI冲M4的表达情况(均n=5)。①干湿重法评估不同组别大鼠大脑半球、海马、梨状皮质的脑含水量;②Nissl染色观察海马CA1区及梨状皮质区神经元坏死情况，免疫组化法观察神经元树突损伤(MAP2)、BBB破坏(内源性IgG)、小胶质细胞活化(Iba1)情况，组织免疫荧光法检测SUR1和TRPM4在海马CA1区与梨状皮质区的阳性细胞数，及SUR1与TRPM4、NueN、vWF是否有共定位;③分别提取不同组别的大鼠海马与梨状皮质的蛋白，Westem blotting法检测SUR1、TRPM4、COX2及IL-6表达水平。第三部分，利用荧光定量PCR法及Westem blotting法检测SE后6h、12h、24h、3d、7d海马区及梨状皮质区SURl与TRPM4的表达情况(均n=5)。第四部分，侧脑室注射Trpm4siRNA或假肽siRNA，Westem blotting检测海马区TRPM4的表达(分别n=5)，Nissl染色观察神经元坏死情况，免疫组化法检测内源性IgG渗漏情况(分别n=5)。
研究结果：
一、氯化锂-匹鲁卡品诱导的sE持续发作2.5小时可引起明显脑水肿、神经损伤、炎症反应以及适当的3天死亡率。
在脑含水量方面，与Non-SE组比较，SE1.5h组大脑半球、海马及梨状皮质区均无明显变化，而SE2h、SE2.5h及SE3h组相应区域脑含水量均明显升高(均P＜0.05)。在BBB破坏方面，SE1.5h、SE2h及SE2.5h组海马区及梨状皮质区均可见IgG颗粒渗漏，SE2.5h组海马区及梨状皮质区IgG颗粒渗漏明显高于SE2h组(分别P＜0.001，P＜0.05)。在神经损伤方面，SE1.5h组海马CA1区与梨状皮质区神经元坏死情况不明显，而SE2h组及SE2.5h组神经元明显坏死，且SE2.5h组较SE2h组严重(分别P＜0.05，P＜0.01)。在神经炎症方面，SE后活化的小胶质细胞与星型胶质细胞数量明显增多。SE2.5h组的小胶质细胞及星型胶质细胞活化情况比SE2h组更明显。在3天生存率方面，Non-SE组为100％(10/10)，SE1.5h组为93.33％(14/15);SE2h组为73.33％(11/15)，SE2.5h组为40％(10/25)。SE3h组(n=20)大鼠的3天累积生存率极低，仅为20％(3/15)。SE1.5h与SE2h组3天生存率与Non-SE组比较，差异无统计学意义(分别P=0.41，P=0.08)，而SE2.5h及SE3h组3天生存率明显低于Non-SE组(分别P＜0.01，P＜0.001)。
二、GBC减轻SE后脑水肿、神经损伤、小胶质细胞活化，抑制SUR1-TRPM4过表达及改善预后。
在脑水肿方面，与Vehicle组大鼠相应脑区比较，GBC组大鼠大脑半球、海马及梨状皮质区脑含水量均明显减少(均P＜0.05);海马CA1区与梨状皮质区IgG渗漏均明显减轻(均P＜0.001)，梨状皮质区IgG渗漏面积也明显减少(P＜0.01)。在神经损伤方面，格列本脲治疗后大鼠海马CA1区及梨状皮质区神经元坏死较Vehicle组明显改善(P＜0.05)，同时海马CA1区树突丢失也明显减轻(P=0.001)。SE28天后GBC组神经元坏死仍较Vehicle组明显改善(分别P＜0.01，P＜0.05)。在神经炎症方面，GBC组大鼠海马CA1区与梨状皮质区小胶质细胞活化情况较Vehicle组明显减轻(分别P＜0.01，P＜0.05)，COX2、IL-6表达也明显减少(分别P＜0.05，P＜0.01)。SE28天后GBC组小胶质细胞活化情况仍较Vehicle组明显减轻(分别P＜0.01，P＜0.001)。在神经功能预后方面，GBC组大鼠SRS发作频率及每次发作持续时间均较Vehicle组明显减少，SRS发生率及发作级别也有下降趋势。水迷宫结果显示，在获得性记忆训练阶段，GBC组大鼠找到平台时间明显少于溶媒对照组，在第4天两组间差异有统计学意义。在第5天的探索实验中，GBC组大鼠平台穿越次数及在平台象限停留时间均明显高于Vehicle组(均P＜0.05)。在28天生存率方面，Vehicle组大鼠生存率为22.22％(8/36)，而GBC组为47.83％(11/23)，GBC组大鼠28天生存率明显高于Vehicle组(x，2=3.877，P=0.045)。在机制探讨方面，SE6小时后海马区及梨状皮质区SUR1、TRPM4在mRNA与蛋白水平均明显升高，SUR1、TRPM4的mRNA水平升高至少持续3天，而蛋白水平升高至少可持续7天。SURl在SE大鼠脑组织的血管内皮细胞及神经元细胞高表达，且与TRPM4共定位。GBC治疗可减少SE3天后海马区及梨状皮质区SURl与TRPM4的过表达(P＜0.01)。另外，使用Trpm4siRNA敲低SE大鼠脑组织TRPM4过表达后，血脑屏障破坏及神经元坏死同样得到改善。GBC在SE大鼠模型中的脑保护作用与抑制SUR1-TRPM4的过表达有关。
研究结论：
一、癫痫持续状态持续发作2.5小时可引起明显的脑水肿、血脑屏障破坏、神经损害及神经炎症。
二、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的脑水肿及血脑屏障破坏。
三、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的海马CA1区及梨状皮质区神经损伤。
四、小剂量的格列本脲治疗减轻癫痫持续状态诱导的神经炎症。
五、小剂量的格列本脲治疗提高癫痫持续状态后28天生存率，并减少自发复发性癫痫的发作及改善学习记忆功能。
六、癫痫持续状态诱导SUR1-TRPM4通道过表达。格列本脲治疗可部分抑制SUR1-TRPM4过表达。敲低癫痫持续状态大鼠脑组织TRPM4的过表达后，可以得到类似于格列本脲治疗的减轻脑水肿及神经元坏死的结果。格列本脲在癫痫持续状态中的脑保护作用与抑制SUR1-TRPM4通道的过度表达有关。