脓毒症（sepsis）以前被认为是感染引起的宿主反应失调所导致的致命性器官功能障碍。近年来临床上更新了对脓毒症定义,认为机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,机体反应失调引起器官功能障碍体现为细胞层面的生理及生化异常。换言之,指宿主对感染原的免疫反应失控,引发炎症反应过度,进而造成免疫衰竭,导致多器官功能障碍或衰竭,最终导致死亡。严重创（烧、战）伤、休克、感染、外科大手术患者易于感染,进而导致宿主产生内稳态失衡,存在潜在致命性风险。临床资料表明,及早识别诊断脓毒症并予以有效防治是提高患者生存率的关键。尽管液体复苏、感染灶的及时清除、抗生素的早期使用及器官功能支持的“集束化治疗”是脓毒症治疗的基石,但迄今脓毒症的病死率仍高达20%。普遍认为,肝脏是脓毒症患者受损的一个重要器官,常常表现为急性肝损伤在,且早期肝功能障碍的脓毒症患者病死率增加。近年来发现,有效调控肝脏免疫细胞及其产生的细胞因子可实现早期诊断与治疗脓毒症的目的。特别是,许多研究认为巨噬细胞在脓毒症引发的肝损伤中发挥至关重要的作用,可见,如何调控巨噬细胞改善脓毒症引发的肝损伤就成为目前应该关注的科学问题。近年研究发现,纳米氧化铁可作为脓毒症诊断和治疗的载体。一些纳米氧化铁具有抗菌和调节炎症反应的作用,且可作为检测脓毒症的标志物;用白蛋白修饰的纳米氧化铁装载的药物处理细菌脂多糖（LPS）诱导的炎症小鼠模型,发现其可减少单核/巨噬细胞和中性粒细胞向炎症部位的浸润;最近发现,一种经美国食品和药物管理局批准的超顺磁性氧化铁颗粒（SPIONs）—Ferumoxytol可诱导肿瘤中的巨噬细胞极化。我们前期也发现SPIONs可诱导巨噬细胞极化,且能减轻LPS诱导的脓毒症小鼠模型的肝损伤,以及抑制巨噬细胞等炎症细胞渗入肝脏。可是,迄今关于SPIONs如何调控巨噬细胞影响脓毒症引发的肝损伤的机制仍然不详。目前认为,间充质干细胞（MSCs）能通过与免疫细胞直接作用或旁分泌多种细胞因子的方式发挥调节免疫、抑制炎症及促进损伤修复等作用。研究表明,MSCs也可通过分泌转化生长因子(TGF-β、前列腺素E（PGE）2、吲哚胺2,3双加氧酶（IDO）及外泌体等抑制促炎性巨噬细胞等增殖和功能,而促进抑炎性巨噬细胞等的产生。我们前期也发现,MSCs可改善盲肠结扎诱导的脓毒症小鼠模型的症状,降低了小鼠死亡率。可是,纳米氧化铁—SPIONs如何影响MSCs,进而调控巨噬细胞影响脓毒症的机制仍不完全清楚。因此,本论文（1）探讨了纳米氧化铁（SPIONs）调控巨噬细胞影响脓毒症肝损伤的机制;（2）分析了 SPIONs对MSCs的影响,揭示了 SPIONs标记的MSCs调控巨噬细胞影响脓毒症肝损伤的机制。1.SPIONs可通过上调巨噬细胞分泌IL-10缓解脓毒症肝损伤:为了考察SPIONs对肝损伤的影响,我们构建了 LPS诱导的脓毒症小鼠模型,造模4小时后通过尾静脉输注SPIONs,然后在建模24小时时,获取小鼠血清和肝脏组织等,检测了脓毒症小鼠肝脏组织的铁含量、血清中的炎症因子及肝脏巨噬细胞的变化。原子吸收光谱分析方法的检测结果表明,LPS诱导的脓毒症小鼠模型肝脏中的铁含量的降低,而尾静脉输注SPIONs可增加模型肝脏中的铁含量。肝脏病理结果显示,与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠模型肝脏出现大量炎性细胞浸润及肝细胞气球样变性和点状坏死,而尾静脉输注SPIONs可明显减轻模型小鼠肝损伤程度及炎性细胞浸润和肝细胞变性的程度。血清学分析结果表明,模型小鼠血清中反映肝脏损伤的敏感指标—谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）的水平显著升高,而SPIONs处理组小鼠血清中ALT和AST水平均显著降低;这些结果提示SPIONs可能通过恢复失调的铁稳态来减轻脓毒症小鼠的肝损伤。进一步,流式细胞术检测结果表明,模型组小鼠肝脏中CD11b+F4/80+巨噬细胞明显增多,但SPIONs处理可减少模型组小鼠肝脏中巨噬细胞数量,而显著增加IL-10阳性巨噬细胞的数量;处理各组小鼠肝脏中Treg细胞没有明显的变化。ELISA检测结果显示,模型组小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平显著增加,而SPIONs处理可降低模型组小鼠血清IL-6和TNF-α水平;特别是,在LPS诱导的脓毒症模型中,SPIONs显著增加血清IL-10水平,提示巨噬细胞产生的IL-10可能在SPIONs减轻肝损伤中发挥作用。为了确定巨噬细胞产生的IL-10在脓毒症肝损伤中的作用,我们分别给正常小鼠和IL-10基因缺陷（IL-10-/-）的小鼠腹腔注射LPS建立小鼠急性脓毒症模型,通过分析模型小鼠的肝脏组织、血清中的炎症因子及肝脏巨噬细胞等的变化,结果表明SPIONs处理并未起到缓解IL-10-/-小鼠脓毒症的作用;体外也显示SPIONs可促进巨噬细胞IL-10的水平;这些结果说明SPIONs减轻肝损伤的作用依赖于巨噬细胞产生的IL-10。2.SPIONs增强巨噬细胞产生IL-10依赖于Cav1-Notch1/HES1信号轴的活化:自噬是真核细胞维持内环境稳态的一种内在平衡机制。近年来的一些研究发现,自噬在脓毒症早期被激活,而在病理发展过程中受到抑制,提高自噬可改善器官损伤;修饰不同的纳米粒子可引起多种细胞如巨噬细胞的自噬;自噬可影响巨噬细胞IL-10的代谢重编。然而,SPIONs如何通过自噬调控巨噬细胞的IL-10表达还不清楚。为了揭示SPIONs增强巨噬细胞产生的IL-10的机制,我们用自噬抑制剂Baf-A1处理RAW 264.7细胞或骨髓诱导的巨噬细胞（BMDMs）,发现抑制巨噬细胞的自噬可显著降低SPIONs促进的巨噬细胞产生IL-10的水平。细胞自噬受多种信号如Notch、PI3K-Akt-mTORC1和AMPK-mTOR信号通路等的调控。我们前期的研究结果表明,Notch-HES-1轴可通过诱导P62控制TLR7介导的巨噬细胞自噬性死亡。为了进一步揭示调控自噬中相关的通路,我们抑制巨噬细胞的Notch通路,发现SPIONs促进产生的IL-10水平同样显著降低,提示Notch 1/HES1信号通路可能与巨噬细胞产生抗炎因子IL-10有关。为了确定SPIONs促进巨噬细胞的自噬,收获不同浓度和时间用SPIONs处理的RAW 264.7巨噬细胞,Western-blot检测结果表明,SPIONs可呈时间和剂量依赖性增加Beclin1和LC3B蛋白的表达;免疫荧光实验结果显示,SPIONs可明显增加巨噬细胞中的点状聚集数量。进一步,我们确定在LPS存在的条件下,SPIONs也能诱导巨噬细胞发生自噬。已有研究报道,小窝蛋白-1（Caveolin-1,Cav1）可表达于巨噬细胞,对脂质转运、胞膜运输和细胞内信号传导通路等都具有调节作用,且参与调节多种细胞生理和病理。为了探索SPIONs如何进入巨噬细胞,我们利用蛋白印记和免疫荧光的方法检测,结果表明SPIONs上调巨噬细胞中Cav1的表达;原子光谱吸收的方法显示,敲除Cav1后的巨噬细胞摄取铁含量下降;提示Cav1可能与巨噬细胞的摄取SPIONs有关。为了阐明Cav1在巨噬细胞的摄取SPIONs引起自噬中的作用,我们高表达或者敲除巨噬细胞的Cav1,结果显示Cav1的表达高/低的确与SPIONs引起的巨噬细胞细胞自噬增加/减弱的密切相关。进一步抑制/干扰Notch通路的受体HES1可显著减弱SPIONs对巨噬细胞自噬的诱导,说明Cav1-Notch1/HES1信号的激活参与SPIONs诱导的巨噬细胞自噬。上述结果揭示了 SPIONs诱导的巨噬细胞自噬的新机制,即SPIONs通过激活Cav1-Notch1/HES1信号轴促进巨噬细胞中IL-10的产生,进而抑制LPS诱导的脓毒症和肝损伤中的炎症。提示SPIONs可能是脓毒症及其肝损伤的潜在治疗剂。3.SPIONs标记的MSCs能通过调控巨噬细胞向M2型极化改善脓毒症肝损伤:前期我们证明了单独SPIONs处理可调控巨噬细胞来治疗脓毒症及其肝损伤。目前临床上MSC广泛应用于如自身免疫病和脓毒症等疾病的治疗。一般认为,在炎症环境下,MSCs能够通过直接接触和旁分泌等方式与巨噬细胞相互作用,抑制M1型巨噬细胞的极化,而促进M2型巨噬细胞的极化,且M2型巨噬细胞分泌的IL-10等具有免疫调节、促进组织修复和抑炎作用。在这里,我们将探讨SPIONs标记MSCs（SPIONs-MSCs）对免疫及炎症的调节作用。首先,我们通过浓度选择,确定200ug/ml的SPIONs刺激不显著影响人脐带来源的MSCs的基本特征,如贴壁性、表面标志（阳性表达CD73、CD90和CD105;阴性表达CD19、CD31和HLA-DR）以及细胞活力和凋亡。为了考察SPIONs-MSCs在体内的免疫抑制功能,我们构建了小鼠盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症模型,于手术后4小时通过尾静脉输注MSCs或SPIONs-MSCs进行治疗。分别在2天和7天时获取小鼠血清和肝脏组织等进行检测。结果表明,SPIONs-MSCs的治疗组的肝脏中存在明显的普鲁士蓝染色的褐色沉积;免疫荧光方法显示,MSCs治疗组和SPIONs-MSCs治疗组都能发现人的CD90和小鼠的F4/80的共定位,并且SPIONs-MSCs组的共定位点多于MSCs组,并且持续时间更长。这些结果说明,SPIONs-MSCs到达了小鼠肝脏,并与肝脏巨噬细胞相互接触甚至被巨噬细胞吞噬。接着我们检测血清中的炎症因子及肝脏巨噬细胞的变化等,发现SPIONs-MSCs 比 MSCs更显著地改善了脓毒症症状,主要表现为:增加小鼠的生存率、降低血清炎性因子TNF-α和IL-6水平、促进血清抗炎因子IL-10的水平、降低血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的浓度、以及缓解肝脏的损伤。为了进一步验证巨噬细胞对脓毒症的作用,我们首先利用小鼠尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体（Clodronate liposome）的方法清除小鼠全身巨噬细胞,然后再次构建小鼠脓毒症模型。48小时后获取相关组织并检测炎症指标,结果表明,脓毒症小鼠的巨噬细胞被清除后,SPIONs-MSCs对小鼠脓毒症肝损伤的修复作用明显降低。流式细胞和免疫荧光的检测结果表明,与单独MSC组相比,SPIONs-MSCs能更有效地降低肝组织内的巨噬细胞数量及M1型巨噬细胞比例,而促进M2型巨噬细胞比例。LPS诱导的小鼠脓毒症模型与CLP模型的检测结果相类似。这些结果提示,SPIONs预处理可能增强MSCs的免疫抑制功能。为了确定SPIONs预处理的MSCs对巨噬细胞免疫调控功能的影响,我们将不同处理的MSCs与巨噬细胞RAW264.7进行共培养,流式细胞术检测结果表明,无论是直接共培养还是间接共培养,SPIONs-MSCs可显著增加M2巨噬细胞的比例,而显著减少M1巨噬细胞的比例,且比单独MSCs相比,SPIONs-MSCs在mRNA和蛋白水平上显著地抑制M1型标志TNF-α和iNOS的表达,而促进M2型标志IL-10和Arg-1的表达。这些结果说明,SPIONs-MSCs可更有效地通过诱导M2巨噬细胞缓解脓毒症及其肝损伤。4.SPIONs标记的MSCs调控巨噬细胞的极化归功于MSCs的TRAF1表达:为了解释SPIONs调控MSCs的机制,我们利用基因芯片分析了 SPIONs预处理的MSC基因变化谱,结果表明,在TNF信号通路中有20多种受体蛋白的基因显著高表达,其中TRAF1的表达最高。研究报道,TRAF蛋白能与TNFR超家族的各种受体相关联,并介导来自这些受体的信号转导;TRAF1和TRAF2形成异二聚体复合物是TNF-α介导的活化丝裂原活化蛋白激酶8/JNK和核因子-κB所必需的;在骨髓来源的MSCs的治疗小鼠脓毒症中,发现LPS刺激巨噬细胞活化产生的TNF-α可使MSCs的TNFR-1受体-NF-κB通路激活,进而上调Cox2及促进PGE2分泌,PGE2反过来诱导巨噬细胞向调节型M2型极化,同时产生高水平的IL-10。然而,TRAF1在MSC调控巨噬细胞的机制中的作用仍不明确。为此,我们用200μg/ml的SPIONs处理MSC,发现SPIONs显著促进TRAF1的高表达,但不影响TRAF2的表达;蛋白印迹检测显示,SPIONs显著激活TRAF1下游信号通路的p65的活化以及Cox2和IL-10的增加,提示SPIONs可能通过TRAF1来激活NF-kB信号通路。为了证明SPIONs可通过上调TRAF1激活NF-κB通路活化进而促进MSCs的免疫调节作用,我们敲除MSC的TRAF1后,并与巨噬细胞共培,结果表明SPIONs预处理的MSCs表达Cox2和IL-10等细胞因子的水平明显降低,且M2巨噬细胞的数量减少。为了确定上述结果,我们构建脓毒症小鼠模型,用敲除TRAF1（siTRAF1）的MSCs治疗后发现,同SPIONs-MSCs相比,SPIONs-MSCs-siTRAF1对LPS引起的肝组织内的巨噬细胞数量异常的影响降低,而促进M2型巨噬细胞比例的能力也下降。这些结果说明,SPIONs-MSCs对巨噬细胞向组织修复M2型的转化依赖于TRAF 1。此外,一些研究报道,血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）可发挥抗炎、细胞保护及诱导耐受等作用,HO-1修饰的MSCs可有效增强MSCs移植入体内后在复杂内环境下抗凋亡特性。为此,我们检测了 LPS环境下,MSC的状态以及HO-1的变化,结果表明,LPS显著下降MSC的活力及HO-1的表达,而SPIONs处理可显著增加MSCs的HO-1表达;经过干扰实验证实,SPIONs可通过促进HO-1的表达,进而增强MSCs的生存。这些结果提示,SPIONs不仅可增强MSCs调节免疫的功能,还可延长MSCs体内生存时间。综上所述,本研究:（1）发现SPIONs诱导巨噬细胞自噬的新机制,即SPIONs通过激活Cav1-Notch1/HES1信号通路,促进巨噬细胞中IL-10的产生,从而抑制LPS诱导的脓毒症及其肝损伤的症状;（2）发现SPIONs预处理的MSCs具有显著促进巨噬细胞向M2型的极化及改善小鼠脓毒症及其肝损伤的效果;（3）揭示SPIONs预处理的MSCs免疫调节功能增强依赖于TRAF1表达的新机制。此外,SPIONs可通过促进HO-1的表达增强MSCs的生存能力。