随着人民生活水平的提高,人们对畜禽肉、蛋、奶制品数量及品质的需求不断地增加,因此规模化养殖场的数量也在不断地增加。然而,畜禽养殖粪污的排放带来了严重的环境问题,尤其是在规模化水泡粪工艺养猪场内,养猪粪污经过长时间的浸泡很难实现固液分离,废水中高氨氮和高化学需氧量导致养猪废水的无害化、资源化处理困难。微生物巢技术又称异位生物发酵床技术是基于微生物发酵原理发明的一种畜禽粪水处理工程技术,它是借用生物发酵床养殖模式,利用锯末、稻壳和作物秸秆等作为“碳源”,畜禽粪水作为“氮源”,形成类似于蜂巢的微生物反应堆,调节此反应堆到合适的碳氮比,然后在此反应堆中通过添加外源复合微生物菌剂来启动微生物巢的发酵,通过微生物的分解发酵作用将养殖粪水转化为二氧化碳和水,以达到消纳粪水的目的,同时还能降垫料和粪污转化为有机肥带来经济效益。然而,微生物巢技术处理养猪粪污过程中微生物群落结构及与环境影响因子之间关系还不明确,对于微生物巢技术处理养猪粪污过程的维护与管理缺乏理论支撑。异养硝化-好氧反硝化（Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD）微生物能够实现在好氧条件下一个反应器内同时进行硝化作用和反硝化作用,其缩短了反应周期,节省了空间和建设成本,同时此类微生物具有较强的环境耐受力,克服了传统生物脱氮的缺陷。但是,HN-AD菌中参与同步异养硝化-好氧反硝化作用的关键酶基因在转录水平上的研究及HN-AD复合菌群的构建与其在废水中生物强化脱氮的应用研究还比较少。本研究以利用微生物巢技术处理水泡粪养猪粪污为例,通过对微生物巢堆体理化性质、光谱学特性及微生物群落结构分析阐述微生物巢处理粪污的机理,为更好的维护和管理微生物巢处理养猪粪污提供理论指导。同时,根据微生物巢处理粪污过程中氮素的变化以及微生物的群落组成,筛选异养硝化-好氧反硝化菌株,探究其脱氮特性、脱氮机理,同时构建复合菌群应用到生物强化脱氮废水中,为养殖废水处理提供新思路。其具体研究内容与结论如下:1.微生物巢技术处理养猪粪污理化性质及光谱学特性研究通过对微生物巢技术处理养猪粪污过程中物料的颜色、气味、温度、含水率、pH、电导率、碳氮比、NH4+-N/NO3--N比、E4/E6和水溶性重金属离子的变化等丽华兴的研究,发现微生物巢技术处理养猪粪污的过程是有机质不断腐值化的过程,此过程可分为升温期（1-7天）、高温期（7-84天）和降温期（84-112天）三个不同的阶段。由微生物巢物料浸提液的三维荧光光谱和红外光谱可知随着发酵时间的推移微生物巢物料浸提液中蛋白类物质的荧光强度在不断减弱,富里酸类和腐殖酸类物质的荧光强度不断地增强,氨基酸类、醇类、酚类、酰胺类、酮类、脂质类和芳香类有机物等峰的强度在逐渐减弱即被不断地分解,进一步证明微生物巢处理养猪粪污过程为腐殖化的过程。2.微生物巢技术处理养猪粪污细菌群落结构分析利用Illumina Miseq测序平台,对微生物巢不同时间（1天、3天、7天、28天、56天、84天和112天）样品的16S rRNA基因V3-V4高变区测序分析。由Alpha多样性分析中的微生物群落的丰富度、多样性、均匀性和覆盖度相关指数发现高温期内物种丰富度高、多样性较高、物种分布均匀及覆盖面广;不同时期的微生物巢堆体中假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、细杆菌属（Microbacterium）和肠杆菌属（Enterobacter）的差异具有显著性;环境因子对细菌群落影响的相关排序为含水率＞温度＞C/N＞pH＞EC＞TN＞TC＞E4/E6＞NO3--N＞NH4+-N;同时经过 FAPROTAX 功能预测发现高温期反硝化作用功能丰度相对较高,这说明微生物巢堆体中存在大量的反硝化细菌,它们将含氮化合物转化为一氧化二氮或氮气排出,这可能是造成微生物巢堆体总氮降低的原因之一。3.微生物巢技术处理养猪粪污真菌群落结构分析利用Illumina Miseq测序平台,对真菌ITS基因高变区ITS 1-ITS2区高通量测序分析,由Ace指数、Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数、Smithwilson指数和Coverage指数变化可知高温期比升温期和降温期细菌物种更丰富多样;整个发酵过程,在门水平上主要为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）;在属水平上高温期双足囊菌科（Dipodascaceae）、黄丝曲霉属（Talaromyces）、镰刀菌属（Fusarium）、节担菌属（Wallemia）、曲霉属（Aspergillus）、木霉属（Trichoderma）、嗜热真菌属（Thermomyces）、青霉菌属（Penicillium）和地霉属（Geotrichu）等嗜热真菌丰度较高,均为纤维素等有机物降解优势菌种;环境因子对真菌群落影响的相关排序为 C/N＞含水率＞EC＞E4/E6＞温度＞TN＞TC＞NO3--N＞NH4+-N＞pH,碳氮比对真菌群落影响最大。4.高效异养硝化-好氧反硝化菌株的筛选及脱氮特性研究根据微生物巢堆体中总氮变化及菌群功能预测,推断微生物巢存在异养型的脱氮菌株。以乙酰胺同时作为碳源和氮源的筛选培养基,从微生物巢样品中筛选出了三株高效异养硝化菌株SDU2、SDU10和SDU20,通过生理生化特性、16S rRNA基因序列的测序及同源性比对并构建系统发育树分析,确定菌株分别为鹤羽田戴尔福特菌（Delftia tsuruhatensis）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）;研究了碳源、碳氮比、温度、pH、转速、金属离子浓度和初始氨氮浓度等不同环境因子对筛选菌株异养硝化特性的影响,确定了最佳反应条件及环境适应能力;好氧条件下,分别以NO3--N和NO2--N作为初始氮源,验证了菌株SDU2、SDU10和SDU20均具有好氧反硝化特性。另外,分别以SNDM1（NH4+-N和NO3--N）和SNDM2（NH4+-N和NO2--N）作为培养基,进行同步异养硝化-好氧反硝化特性的验证。5.菌株P.stutzeri SDU10脱氮机制的探讨通过对菌株SDU10全基因组测序,菌株SDU10基因组总长度为4590354 bp,GC含量为63.88%。编码基因预测结果显示该菌株共有4406个编码基因,61个tRNA,3个rRNA,57个sRNA,基因占基因组百分比为87.27%。其中与脱氮代谢有关的基因共22个,包括氨单加氧酶基因amoA、硝酸盐还原酶基因napA和亚硝酸盐还原酶基因nirS。通过对基因amoA、napA和nirS的敲除,限制了菌株SDU10的生长及代谢,与野生菌株相比敲除菌株对氨氮、硝态氮和亚硝态氮的去除均有显著降低,分别为8.5%、18.5%和21.6%,同时基因的敲除使相关基因的转录下调,进一步验证了这三种基因在异养硝化-好氧反硝化过程中的重要性。6.异养硝化-好氧反硝化复合菌群的构建及生物强化脱氮作用研究首先,在摇瓶水平下SDU2、SDU10和SDU20处理养猪废水,在添加了额外碳源的情况下其氨氮和COD去除率均要高于不添加额外碳源的废水,验证了筛选菌株具有应用于废水处理的潜能;其次,通过正交实验,构建了菌株SDU2、SDU10和SDU20初始添加量体积比为2:3:3的复合菌群;利用SDU2、SDU10和SDU20构成的复合菌群进行生物强化脱氮实验,强化期实验组SBR1反应器内的COD和NH4+-N迅速降低,去除率分别为93.7%和88.9%。而对照组SBR2反应器内COD和NH4+-N去除率分别为75.8%和68.4%,说明复合菌群的添加能有效去除反应器内COD和NH4+-N浓度。同时,SBR1反应器添加复合菌群之后,两个反应器的群落结构发生变化,SBR1内复合菌群的添加使强化期内产碱杆菌属（Alcaligenes）、柠檬酸菌属（Citrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、食酸菌属（Acidovorax）和副球菌属（Paracoccus）成为优势物种,比SBR2反应器内丰度高,复合菌群的添加改变了其菌群结构,好氧反硝化菌群逐渐增多,同时结合SBR1反应器出水氨氮浓度和COD浓度变化,推测出复合脱氮菌群的添加有利于污泥菌群结构的调整,能够实现生物强化脱氮。