【摘 要】
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肝脏担负着机体许多重要的生理功能,极易受到损伤。药物滥用、病毒感染、疾病恶化等各种因素都易诱发肝癌。随着宠物行业的发展,动物的肝癌患病率在不断上升,危害巨大,常用的手术、西药治疗存在一定的弊端,中兽医介入治疗成为了一个新的治疗思路。中兽医认为,肝癌病因多为湿热毒邪入侵机体,或饮食不节致脾胃损伤,或因脏腑虚弱致阴阳失和,气血郁滞于胁腹,积聚中焦。该病病位在肝、脾,亦与胆、胃、肾有关。病程初期较为隐匿
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肝脏担负着机体许多重要的生理功能,极易受到损伤。药物滥用、病毒感染、疾病恶化等各种因素都易诱发肝癌。随着宠物行业的发展,动物的肝癌患病率在不断上升,危害巨大,常用的手术、西药治疗存在一定的弊端,中兽医介入治疗成为了一个新的治疗思路。中兽医认为,肝癌病因多为湿热毒邪入侵机体,或饮食不节致脾胃损伤,或因脏腑虚弱致阴阳失和,气血郁滞于胁腹,积聚中焦。该病病位在肝、脾,亦与胆、胃、肾有关。病程初期较为隐匿,临床表现不明显,发病后,常表现为右胁疼痛、胀满,食欲减弱,形体消瘦,或有黄疸。故以疏肝健脾,祛湿化瘀,清热解毒为治疗准则。赶黄草复方为本实验室自拟复方,前期研究得到此复方最佳配比,初步证明其有抗炎的功效。在此基础上,初步探究该复方对HepG2细胞生长是否有影响,再根据国家中兽药新药制备要求,将此复方制备为颗粒剂,并探究该颗粒诱导HepG2细胞凋亡机制。为赶黄草颗粒的临床应用提供一定的理论基础。1、探究了赶黄草复方对HepG2细胞凋亡的影响。通过CCK-8法探究赶黄草复方对HepG2细胞的增殖效果,初步证实赶黄草复方能有效抑制HepG2细胞的增殖,并且呈一定的剂量和时间依赖性。Hoechst33342/PI双染法探究赶黄草复方是否能诱导HepG2细胞凋亡。结果表明赶黄草复方能有效诱导HepG2细胞的凋亡,并且呈一定的剂量和时间依赖性。初步证明该复方能诱导HepG2细胞凋亡,该复方具有一定的研究意义。2、探究了赶黄草复方中主要成分槲皮素的HPLC测定条件,以目标峰出峰情况为指标,通过控制变量依次探索试验条件,得到最优液相色谱条件为:C18色谱柱,检测波长:254 nm;体积流量:1 m L/min;柱温:40℃;进样量:15μL;流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸水（B）二元线性梯度洗脱（0～30 min,有机相先增大至75%,30～40min再逐步回到起始状态）。该色谱条件下的目标峰峰形尖锐对称,分离效果好,且拖尾因子、理论塔板数、分离度等均符合要求,可作为赶黄草复方中有效成分槲皮素的最佳液相色谱条件。3、探究了赶黄草复方的最优提取浓缩工艺。采用水蒸气蒸馏法、水煎法、乙醇超声提取相结合的方法进行提取,运用正交设计开展赶黄草复方提取工艺筛选试验,以槲皮素保留率为指标,考察最优提取工艺。得到最佳提取工艺后,经验证该工艺合理可行。4、探究了赶黄草颗粒的成型工艺,并对该颗粒质量控制进行研究。首先考察单一辅料,选择最优的辅料种类,再进行辅料配比筛选,确定该颗粒剂的辅料组成,最后用混料设计进行优化,得到成型颗粒剂。为有效控制该颗粒的质量,保持其有效性,对赶黄草颗粒的性状鉴定,有效成分定性、定量鉴别,对其质量控制进行研究。结果表明,赶黄草颗粒为棕黄色颗粒,采用薄层色谱法对有效成分槲皮素进行鉴定时,重现性好、专属性高。采用高效液相色谱法测定赶黄草颗粒中槲皮素的含量时,所建立方法的精密度、重复性、稳定性、加样回收率、专属性均符合药典中对高效液相色谱法的要求。最终优化后的赶黄草颗粒制备方法处方组合可靠。5、探究了赶黄草颗粒诱导HepG2细胞凋亡的机制。试验选取了凋亡过程中关键的凋亡基因Bcl-2、Bax和Caspase-3基因进行探究。采用ELISA法测定赶黄草颗粒对HepG2细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3含量的影响,通过q RT-PCR法检测赶黄草颗粒对Bcl-2、Bax和Caspase-3基因的表达情况。ELISA法检测发现,赶黄草颗粒能降低Bcl-2水平、增加Bax和Caspase-3水平,有效诱导HepG2细胞凋亡。q RT-PCR法检测结果显示,赶黄草颗粒能有效降低HepG2细胞中Bcl-2基因的表达,提高Bax和Caspase-3基因的表达,通过调节这些凋亡基因以此达到促进HepG2细胞凋亡的作用。推测其凋亡机制可能与调控Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路相关。综上所述,本试验建立的赶黄草复方中槲皮素HPLC测定条件稳定可靠,并确定了赶黄草颗粒的最佳提取、浓缩和成型工艺,初步建立了赶黄草颗粒的质量标准。并且,赶黄草颗粒能抑制HepG2细胞的增殖,诱导HepG2细胞凋亡。为赶黄草颗粒的开发和应用奠定了基础。
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