【摘 要】
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研究背景和目的伤口愈合是一个复杂的过程,许多机制尚不清楚。多种因素,如糖尿病、感染等会导致伤口不愈,甚至是截肢、死亡等情况。因此,发现和阐明伤口愈合过程中的新靶标和作用机制具有重要意义。本课题旨在研究脂肪因子Meteorin-like（Metrnl）在伤口愈合中的作用和血管新生的相关机制,为临床难愈性伤口的治疗提供新靶标。研究方法1、检测皮肤伤口组织中Metrnl的m RNA表达随时间的变化。比较
【基金项目】
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国家自然科学基金重点项目（№81730098）；
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研究背景和目的伤口愈合是一个复杂的过程,许多机制尚不清楚。多种因素,如糖尿病、感染等会导致伤口不愈,甚至是截肢、死亡等情况。因此,发现和阐明伤口愈合过程中的新靶标和作用机制具有重要意义。本课题旨在研究脂肪因子Meteorin-like（Metrnl）在伤口愈合中的作用和血管新生的相关机制,为临床难愈性伤口的治疗提供新靶标。研究方法1、检测皮肤伤口组织中Metrnl的m RNA表达随时间的变化。比较全身Metrnl基因敲除小鼠(Metrnl-/-)和对照小鼠（WT）皮肤伤口愈合速度,明确Metrnl对皮肤伤口愈合的作用。2、构建慢病毒载体对原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中Metrnl的表达进行敲减。比较敲减组（sh RNA-Metrnl,sh Metrnl）与对照组（sh RNA-Scramble,sh Scr）3个血管新生指标:细胞增殖、迁移和成管;用Metrnl重组蛋白刺激原代HUVECs,考察体外Metrnl对于内皮细胞血管新生的作用。3、取第3、7天Metrnl-/-组与WT组小鼠的皮肤伤口组织,通过免疫荧光标记CD31,比较两组小鼠血管新生的差异;进一步考察内皮特异性Metrnl基因敲除小鼠(EC-Metrnl-/-)和对照小鼠（WT）皮肤伤口愈合的差异,明确内皮Metrnl缺乏是否为影响伤口愈合的关键因素。4、探究Metrnl调控血管新生的机制。检测Metrnl敲减后原代HUVECs中肝细胞生长因子（HGF）、内皮再生和血管修复相关通路磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基γ（p110γ）/叉头框蛋白M1（FOXM1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）的m RNA表达情况。5、用VEGFA重组蛋白刺激sh Metrnl组和sh Scr组,比较细胞增殖表型的差异。考察在VEGFA重组蛋白刺激下,sh Metrnl组和sh Scr组胞内AKT/e NOS信号通路中AKT,e NOS,p-AKT（T308）,p-AKT（S473）,p-e NOS（S1177）的蛋白表达差异。明确Metrnl敲减对内皮细胞AKT/e NOS信号通路的的影响。研究结果1、皮肤组织Metrnl的m RNA在伤口造模后表达显著升高。Metrnl-/-组小鼠皮肤伤口愈合率在多个时间点显著慢于WT组。2、经检测转染慢病毒后原代HUVECs中Metrnl的m RNA表达下降80%,蛋白表达下降74%。在此敲减条件下,CCK-8和Brdu实验结果显示sh Metrnl组增殖能力显著低于sh Scr组。划痕实验和Matrigel成管实验显示sh Metrnl组迁移能力和成管能力与sh Scr组相比都被显著抑制。外加Metrnl重组蛋白刺激原代HUVECs 24 h,CCK-8结果显示1、3、10、30、100 ng/m L的Metrnl重组蛋白可以促进原代HUVECs增殖。划痕实验显示3、10 ng/m L的Metrnl重组蛋白可以增强原代HUVECs迁移能力。Matrigel成管实验显示10 ng/m L的Metrnl重组蛋白可以显著促进原代HUVECs的成管。3、CD31免疫荧光标记结果显示Metrnl-/-组小鼠在第7天皮肤伤口的血管新生明显弱于WT组。且EC-Metrnl-/-组小鼠皮肤伤口愈合延迟,在多个时间点显著慢于WT组。4、与sh Scr组相比,sh Metrnl组中与内皮血管新生功能相关分子HGF,p110γ/FOXM1的m RNA表达下降,而VEGFA和VEGFR2的m RNA表达升高。5、VEGFA重组蛋白可以显著促进sh Scr组细胞增殖,但在sh Metrnl组该促增殖作用消失。在VEGFA重组蛋白刺激下,sh Metrnl组AKT/e NOS信号通路中p-AKT（S473）和p-e NOS（S1177）的蛋白水平相比sh Scr组是显著下调的,而AKT,e NOS,p-AKT（T308）的蛋白表达不变。研究结论1、Metrnl缺乏可以显著减缓小鼠皮肤伤口愈合,该作用与内皮Metrnl介导的血管新生机制有关。2、细胞内Metrnl缺乏可显著抑制血管新生。外源性Metrnl可促进细胞血管新生。3、Metrnl缺乏可能通过影响VEGFA下游AKT/e NOS信号通路的磷酸化从而抑制内皮的血管新生。此外,Metrnl缺乏导致的血管新生不足可能与HGF、p110γ/FOXM1的表达下调有关。4、研究首次揭示了Metrnl在伤口愈合和血管新生中具有重要作用,为治疗难愈性伤口和血管新生相关疾病提供新靶标、新思路。
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