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[目的]观察2012年8月-2013年4月双氢青蒿素哌喹片治疗中缅边境的恶性疟病人的疗效,监测青蒿素类药物在人体内的敏感性;监测中缅边境恶性疟原虫的K-13基因的多态性;探讨两种体外敏感性检测方法:传统的微量法检测半效抑虫浓度(IC50)和 0-3 小时环状体生存率(survival rates of the ring stage RSA%)对中缅边境恶性疟原虫的青蒿素敏感性评价效果和K-13基因变异的相关性。[方法]1我们于2012年8月-2013年4月在中缅边境周边的8个自然村做临床追踪试验。病例选择1-60岁确诊为恶性疟的病人,治疗前原虫密度≥100个/ul,排除有严重合并症和重叠其它类型的疟原虫的感染者。用双氢青蒿素哌喹片(每片含双氢青蒿素40mg,磷酸哌喹320mg)分2天4次口服,按病人的体重给药。治疗前、服药后第1、2、3、7、14、21、28和42天随访,观察患者症状、体温、外周血涂片中的疟原虫(无性体和配子体)的密度和药物的不良反应。计算患者的体温复常率、原虫无性体阴转率和配子体阴转率,采用WHO推荐的方法(具体评价指标为体温复常率、恶性疟原虫无性体阴转率)来评价疗效。2收集2007-2013年中缅边境恶性疟病人治疗前的外周血及滤纸血。提取原虫血DNA(经体外培养成活的用含原虫的静脉血样本提取原虫DNA,未培养成活的用滤纸血提取DNA)共178株,采用聚合酶链式反应(PCR)方法,扩增恶性疟原虫的PF3D7-1343700(K-13)基因,对目标基因进行全基因测序,比对。对不同年份的疟原虫的K-13基因变异作对比。3来自中缅边境的恶性疟病人体内的疟原虫按临床试验的疗效分为2组,口服双氢青蒿素哌喹片,在治疗后第3天外周血涂片显微镜下检查原虫,能检出原虫的为原虫清除延迟株；未检出疟原虫的为敏感株。两组按1:1配比,每组各16株。检测两组疟原虫株对3种抗疟药:青蒿號酯(Artesunate，AS)、双氢青蒿素(Dihydroartemisinine,DHA)和青蒿素(artemisinin,ART)的半效抑虫浓度(IC50值)和0-3小时环状体生存率(RSA%)。分别比较来自病人体内的虫株和国际标准株3D7(敏感株)的IC50值和RSA值两种指标之间有无差异;分别比较原虫清除延迟株和敏感株两组的ICso值和RSA值间有无明显差异。将K-13基因变异(氨基酸400位点后有变异和MN插入)的虫株分别和无变异虫株进行两种指标(IC50值和RSA值)比较,了解有无显著性差异。[结果]1纳入临床试验109人,其中71人完成全程42天随访。完成随访的71例病例的平均退热时间为29.8 ± 6.7h,原虫清除时间中位数36.9h。在治疗后第3天患者体温复常率为100.0%，原虫无性体的阴转率为92.9%;在治疗后第7天患者体温复常率和原虫无性体的阴转时间均为100.0%。治疗前携带配子体的病人有19例,在治疗的第3、7、14天配子体的清除率为89.5%、94.7%、100.0%。治疗期间患者均未发生明显的不良反应。2 178株恶性疟原虫K-13基因变异有137-142位点有MN、NNN插入和16种单核苷酸突变:K189T、、Nl1Y、E252Q、R225K、1352T、;F446I、N458Y、C469Y、L492S、F495L、R539T、P553L、P574L、580Y、A676D、H719N。178份标本中有106株存在137-142位点MN插入(占59.6%),最多的点突变为F446I 54株(占30.3%),440位点后变异占74株(占41.6%)。400位点后突变几乎都有MN插入;2007年野生株11/25株(占44.0%),2008年野生株19/47(占 40.4%),而 2009 年野生株 7/65 株(占 10.8%)2010-2013 年的野生株4/41株(占9.8%)。经统计学比较,各年份间野生株的构成比有显著性差异(P<0.05),MN插入和氨基酸(AA)400位点后变异的比率也有显著性差异。(P<0.05)。3青蒿素敏感原虫株的AS的IC50值为3.30 ± 0.96nM,DHA的IC50值为2.85±0.82nM,ART的IC50值为5.62±0.99nM;原虫清除延迟株的AS的IC50值为3.53±0.83nM,DHA 的 IC50 值为 3.09±0.76nM,ART 的 IC50值为 5.80±0.97nM;两组IC50值对比,P>0.05，无显著性差异。3D7的AS的IC50值为3.47±0.84nM,DHA 的 IC50值为 2.59±0.97nM,ART 的 IC50值为 5.55±0.87nM,来自病人体内的原虫株和国际标准株3D7的3种抗疟药的IC50值对比,无显著性差异,P>0.05。有K-13基因变异(AA NN插入和400位点后变异)的原虫株和无变异株对3种抗疟药的IC50值无显著性差异(P＞0.05)。中缅边境病人体内的原虫株的RSA中位数为5.40%，3D7的RSA为0.8%,来自病人体内的虫株和3D7的RSA对比有显著性差异(P＜0.05),来自病人体内的原虫株最大的RSA是3D7的40倍；原虫清除延迟株的RSA中位数为12.8%,敏感株的RSA为3.5%,原虫清除延迟株和敏感株的RSA对比有显著性差异(P＜0.05);有K13基因变异组(NN插入和400位点后变异)的RSA和无变异组的RSA相比有显著性差异(P＜0.05)。[结论]1中缅边境的恶性疟原虫对双氢青蒿素哌喹片的治疗总体是敏感的,但存在少部分病例(7.1%)在治疗后第3天外周血涂片中仍可检出疟原虫,提示出现原虫清除延迟。青蒿素治疗后人体的体温复常时间短于疟原虫清除时间。2中缅边境的恶性疟原虫K-13基因变异主要以NN插入和氨基酸400位点后变异为主,F446I为主要的变异类型,随着时间的推移,野生株越来越少,变异株越来越多。3中缅边境的恶性疟原虫的半效抑虫浓度(IC50值)不能反映体内青蒿素的敏感性,RSA可反映体内青蒿素类药物的敏感性,RSA是测定青蒿素类药物抗药性的重要实验方法。K-13基因变异(NN插入和400位点后变异)与恶性疟原虫在DHA作用下高的生存率有关,K-13基因变异和青蒿素类药物疗效下降相关。