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鸡球虫病是由艾美耳球虫引起的一种危害极为严重的全球性寄生虫病，雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后精神萎顿、体温下降、逐渐排泄血便，病愈雏鸡增重和产蛋能力降低，给鸡规模化养殖带来巨大的经济损失。目前，柔嫩艾美耳球虫相关研究已不仅限于柔嫩艾美耳球虫对宿主致病作用，有关柔嫩艾美耳球虫与肠道菌群的相互作用备受关注。柔嫩艾美耳球虫感染宿主后常导致肠道菌群失衡，菌群中增加的致病菌进一步加深肠道炎症，而减少的益生菌可以通过平衡肠道菌群、提高机体免疫能力减轻球虫感染对雏鸡危害程度。本实验首先经16s高通量测序分析柔嫩艾美耳球虫裂子生殖时期、配子生殖时期及卵囊排出时期对肠道菌群的影响，筛选出感染球虫后降低的益生菌菌株经体外入侵实验筛选出具有抑制子孢子入侵能力的菌株。将有效菌株进行动物实验，检测益生菌对雏鸡相对增重率、血便记分、盲肠病变程度、盲肠内容物中的卵囊值、粪便中的卵囊排出量、抗球虫指数及外周血淋巴细胞含量评定益生菌的抗球虫效果，旨在为微生态制剂预防柔嫩艾美耳球虫感染提供理论依据，主要研究内容及结果如下：
(1)柔嫩艾美耳球虫感染雏鸡盲肠肠道菌群的影响：将40只AA肉鸡于21日龄经口感染5×104个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊，分别收集未感染以及感染柔嫩艾美耳球虫后105小时(裂殖子时期)、144小时(配子时期)、214小时(卵囊排出阶段)肠道内容物进行高通量测序。在正常肉鸡盲肠肠道菌群中，厚壁菌门(Firmicutes )、拟杆菌门(Bacteroides)、软壁菌门(Phylum Tenericutes)、变形菌门(Proteonacteria)所占比例分别为63.06%、33.32%、1.72%、1.24%。在第二代裂殖子时期，厚壁菌门和软壁菌门的相对丰度分别增加到65.98%和2.11%，拟杆菌门和变形菌门的相对丰度分别下降到29.20%和1.14%。配子阶段，厚壁菌门、软壁菌门分别减少至49.88%、0.46%，拟杆菌门、变形菌门增加到43.82%、5.26%。随着卵囊从肠道细胞的逐渐排出，厚壁菌门、软壁菌门相对丰富上升至54.25%、1.29%，拟杆菌门、变形菌门相对丰度下降至42.01%、1.47%。在菌属水平上，重要菌属包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属UCG-013(Ruminococcaceae-UCG-013)以及沙特沃尔斯特菌属(Shuttleworthia)在球虫发育至裂殖生殖时期相对丰度降低，配子生殖时期相对丰度显著减少，卵囊排出阶段相对丰度逐渐增加。在配子生殖时期，主要致病菌肠球菌属(Enterococcus)、嗜胆菌属(Bilophila)在肠道菌群相对丰度逐渐升高。卵囊排出阶段肠球菌属、嗜胆菌属相对丰度较正常菌群减少。链球菌属(Sireptococcus)从球虫感染至卵囊排出阶段相对丰度不断升高。在菌种水平上，益生菌乳酸乳球菌、唾液乳杆菌、阴道乳杆菌在雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后相对丰度减少。结果说明，雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后软壁菌门、厚壁菌门、乳酸杆菌属、瘤胃球菌属UCG-013、沙特沃尔斯特属、乳酸乳球菌、唾液乳杆菌、阴道乳杆菌相对丰度降低，含有致病菌的拟杆菌门、变形菌门、肠球菌属、嗜胆菌属相对丰度升高。
(2)球虫感染后降低的益生菌体内外抗球虫效果研究：根据高通量测序结果筛选出阴道乳杆菌(L.vagina)、唾液乳杆菌(L. salivarius)、乳酸乳球菌(L. lactis)。建立柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵模型，流式细胞术检测对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。体内实验：雏鸡从1日龄开始经口饲喂阴道乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌，连续27天，28日龄攻虫并于攻虫后第7天检测各实验组雏鸡外周血淋巴细胞含量变化情况以及相对增重率、盲肠病变评分、血便评分、OPG计数、ACI以及外周血淋巴细胞含量变化情况。
实验结果显示，1×107cfu阴道乳杆菌对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞具有显著抑制作用(P＜0.05)，1×107cfu乳酸乳球菌、5×107cfu乳酸乳球菌、1×107cfu唾液乳杆菌、5×107cfu阴道乳杆菌实验组(P＜0.01)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞具有极显著抑制作用(P＜0.01)，5×107cfu唾液乳杆菌可以极显著抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞(P＜0.001)。流式细胞术检测外周血淋巴细胞，结果显示乳酸乳球菌组，唾液乳杆菌组雏鸡外周血CD3+CD8+T淋巴细胞含量升高，阴道乳杆菌组与阳性对照组相比差异显著(P＜0.05)。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组雏鸡相对增重率分别为54%、55%、56%均高于阳性对照组。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组OPG计数分别为1.3±0.28、0.3±0.14、0.8±0.14显著低于阳性对照组(P＜0.05)，乳酸乳球菌组OPG值显著低于唾液乳杆菌组和阴道乳杆菌组(P＜0.05)。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组，盲肠病变记分分别为2、2.6、2.2均显著低于阳性对照组(P＜0.05)。阴道乳杆菌组，唾液乳杆菌组血便评分均为1，低于阳性对照组血便评分。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组ACI指数分别为124、124、125，均达到中等抗球虫效果。
本研究表明雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，益生菌减少，致病菌及条件性致病菌增加。阴道乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌具有较好的抗球虫作用，其结果将为研究抗柔嫩艾美耳球虫益生菌制剂研究提供理论依据。
(1)柔嫩艾美耳球虫感染雏鸡盲肠肠道菌群的影响：将40只AA肉鸡于21日龄经口感染5×104个/只柔嫩艾美耳球虫卵囊，分别收集未感染以及感染柔嫩艾美耳球虫后105小时(裂殖子时期)、144小时(配子时期)、214小时(卵囊排出阶段)肠道内容物进行高通量测序。在正常肉鸡盲肠肠道菌群中，厚壁菌门(Firmicutes )、拟杆菌门(Bacteroides)、软壁菌门(Phylum Tenericutes)、变形菌门(Proteonacteria)所占比例分别为63.06%、33.32%、1.72%、1.24%。在第二代裂殖子时期，厚壁菌门和软壁菌门的相对丰度分别增加到65.98%和2.11%，拟杆菌门和变形菌门的相对丰度分别下降到29.20%和1.14%。配子阶段，厚壁菌门、软壁菌门分别减少至49.88%、0.46%，拟杆菌门、变形菌门增加到43.82%、5.26%。随着卵囊从肠道细胞的逐渐排出，厚壁菌门、软壁菌门相对丰富上升至54.25%、1.29%，拟杆菌门、变形菌门相对丰度下降至42.01%、1.47%。在菌属水平上，重要菌属包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、瘤胃球菌属UCG-013(Ruminococcaceae-UCG-013)以及沙特沃尔斯特菌属(Shuttleworthia)在球虫发育至裂殖生殖时期相对丰度降低，配子生殖时期相对丰度显著减少，卵囊排出阶段相对丰度逐渐增加。在配子生殖时期，主要致病菌肠球菌属(Enterococcus)、嗜胆菌属(Bilophila)在肠道菌群相对丰度逐渐升高。卵囊排出阶段肠球菌属、嗜胆菌属相对丰度较正常菌群减少。链球菌属(Sireptococcus)从球虫感染至卵囊排出阶段相对丰度不断升高。在菌种水平上，益生菌乳酸乳球菌、唾液乳杆菌、阴道乳杆菌在雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后相对丰度减少。结果说明，雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后软壁菌门、厚壁菌门、乳酸杆菌属、瘤胃球菌属UCG-013、沙特沃尔斯特属、乳酸乳球菌、唾液乳杆菌、阴道乳杆菌相对丰度降低，含有致病菌的拟杆菌门、变形菌门、肠球菌属、嗜胆菌属相对丰度升高。
(2)球虫感染后降低的益生菌体内外抗球虫效果研究：根据高通量测序结果筛选出阴道乳杆菌(L.vagina)、唾液乳杆菌(L. salivarius)、乳酸乳球菌(L. lactis)。建立柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵模型，流式细胞术检测对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。体内实验：雏鸡从1日龄开始经口饲喂阴道乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌，连续27天，28日龄攻虫并于攻虫后第7天检测各实验组雏鸡外周血淋巴细胞含量变化情况以及相对增重率、盲肠病变评分、血便评分、OPG计数、ACI以及外周血淋巴细胞含量变化情况。
实验结果显示，1×107cfu阴道乳杆菌对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞具有显著抑制作用(P＜0.05)，1×107cfu乳酸乳球菌、5×107cfu乳酸乳球菌、1×107cfu唾液乳杆菌、5×107cfu阴道乳杆菌实验组(P＜0.01)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞具有极显著抑制作用(P＜0.01)，5×107cfu唾液乳杆菌可以极显著抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵MDBK细胞(P＜0.001)。流式细胞术检测外周血淋巴细胞，结果显示乳酸乳球菌组，唾液乳杆菌组雏鸡外周血CD3+CD8+T淋巴细胞含量升高，阴道乳杆菌组与阳性对照组相比差异显著(P＜0.05)。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组雏鸡相对增重率分别为54%、55%、56%均高于阳性对照组。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组OPG计数分别为1.3±0.28、0.3±0.14、0.8±0.14显著低于阳性对照组(P＜0.05)，乳酸乳球菌组OPG值显著低于唾液乳杆菌组和阴道乳杆菌组(P＜0.05)。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组，盲肠病变记分分别为2、2.6、2.2均显著低于阳性对照组(P＜0.05)。阴道乳杆菌组，唾液乳杆菌组血便评分均为1，低于阳性对照组血便评分。阴道乳杆菌组、唾液乳杆菌组、乳酸乳球菌组ACI指数分别为124、124、125，均达到中等抗球虫效果。
本研究表明雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，益生菌减少，致病菌及条件性致病菌增加。阴道乳杆菌、唾液乳杆菌、乳酸乳球菌具有较好的抗球虫作用，其结果将为研究抗柔嫩艾美耳球虫益生菌制剂研究提供理论依据。