研究背景:随着骨免疫学说的发展,免疫细胞对骨缺损修复的积极作用引起学术界的广泛关注,摒弃以往追求“惰性”生物材料的理念,更多的学者致力于研发一种具骨免疫调节性能的生物材料,即通过改变免疫细胞行为而营造利于骨再生的免疫微环境,最终达到生物材料促进骨再生修复的目的。巨噬细胞作为生物材料介导机体反应的主要参与者,其促炎M1分型与抑炎M2分型的转换调控着骨髓间充质干细胞成骨分化及成骨/破骨稳态平衡。生物材料植入后的炎症环境下,M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转换是骨缺损修复的关键环节。基于巨噬细胞的高度可塑性,相关研究证实了负电荷能抑制巨噬细胞炎症反应,正电荷则刺激其炎症因子分泌,但表面电荷对巨噬细胞的调控作用的相关研究较少涉及骨组织再生领域。聚偏氟乙烯-三氟乙烯膜（Poly（vinylidene fluoride trifluoroethylene）,P（VDF-TrFE））是一种适用于组织再生的电活性薄膜,其具备高压极化后表面带电的铁电性能。本课题基于巨噬细胞对表面电荷的生物学效应,以研发具骨免疫调节性能的生物膜为目的,制备双面异电的P（VDF-TrFE）膜,并通过体内外实验评价携带正、负电荷的膜表面对巨噬细胞M1/M2表型转换的调节作用,并进一步明确其介导的巨噬细胞微环境对成骨分化的影响。本研究有望为生物材料骨免疫调节性能的研发提供创新性思路,为电活性材料的临床应用奠定实验基础。研究方法:1.P（VDF-TrFE）膜的制备及高压极化,并对其物理性能和晶相组成进行表征;压电常数D33检测仪、扫描探针显微镜、Zeta电位分析仪检测材料的电学性能并表征其表面电荷。2.采用CCK-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞增殖及毒性;RAW264.7巨噬细胞接种于P（VDF-TrFE）膜上并利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）进行M1极化诱导,验证诱导成功后,使用该模型培养巨噬细胞24小时,采用细胞骨架染色、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）、免疫印迹实验（Westen Blot,WB）等技术检测巨噬细胞M1/M2极化的活性,以揭示不同带电P（VDF-TrFE）膜对M1型巨噬细胞向M2型转换的调节作用。3.配制巨噬细胞-P（VDF-TrFE）膜条件培养基（Conditioned medium,CM）,刺激培养骨髓间充质干细胞（Rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs）,采用荧光染色、碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）染色、茜素红染色、PCR、WB等实验技术检测rBMSCs成骨活性,以评价带电P（VDF-TrFE）膜-巨噬细胞微环境对rBMSCs成骨分化的影响。4.构建大鼠下颌角临界骨缺损的动物模型并行植膜手术,通过HE染色、免疫组织化学染色技术观察带电P（VDF-TrFE）膜的成骨效能及其周围巨噬细胞的表型分布情况。研究结果:1.高压极化后P（VDF-TrFE）膜正反两面的Zeta电位分别为（59.67±5.03）mV和（-74.00±5.57）mV,根据表面携带电荷的性质将极化后材料分为负电性（Negatively charged,N-C）、正电性（Positively charged,P-C）P（VDF-TrFE）膜,未极化的不带电（Uncharged,U-C）P（VDF-TrFE）膜作为对照组。2.带电P（VDF-TrFE）膜对巨噬细胞无明显毒性作用,P-C组的巨噬细胞增殖情况均优于N-C、U-C组（P<0.05）;ELISA、PCR结果显示负电性P（VDF-TrFE）膜能上调巨噬细胞的Arg-1、IL-10抗炎因子的表达水平,抑制LPS诱导的炎症因子iNOS、TNF-α的分泌,同时上调巨噬细胞自噬相关蛋白LC3II的表达水平（P<0.05）。3.rBMSCs的ALP染色、茜素红染色结果提示N-C组巨噬细胞的CM刺激rBMSC产生更多ALP及矿化结节,WB、PCR结果也显示了其COL-I、OPN、ALP等成骨相关基因及蛋白的表达水平较高（P<0.05）。4.N-C组可见更多的新生骨质,骨愈合最佳;免疫组化结果揭示了 N-C组骨缺损周围可见更多的Arg-1阳性细胞。研究结论:1.本实验成功制备P（VDF-TrFE）膜,并且通过高压极化赋予薄膜以良好且稳定的电学性能。2.负电性P（VDF-TrFE）膜促进M1型巨噬细胞向M2型发生转换;其诱导巨噬细胞M1向M2表型的转换对rBMSCs的成骨分化具备一定的促进作用。3.负电性P（VDF-TrFE）膜在体内仍具备良好的成骨作用及M2极化的激活功能。