论文部分内容阅读
研究背景与目的白癜风是一种常见的获得性色素脱失性疾病,其典型特征是境界清晰的色素脱失斑,影响全球人口的0.5～2%,且可合并其他自身免疫性疾病（即共病）。该病的发病机制尚不完全清楚,目前多认为是自身免疫导致的黑素细胞破坏。因为美观（尤其是暴露部位）和共病,白癜风给患者的内心和社交等产生了极大的影响,可导致严重的心理负担。因此,积极有效的治疗显得尤为重要。目前白癜风的常规疗法包括药物（局部和系统治疗）、光疗、手术（包括表皮移植、毛发移植等）等,其中光疗（包括311nm和308nm紫外线）是治疗白癜风的有效措施之一。各种疗法的最终目标是复色,其模式以毛囊周围型最为常见,但具体的复色机制尚未明确,因此白癜风的治疗仍面临着很大的困难。毛囊周围复色模式提示复色的黑素细胞来源于毛囊。有研究指出,毛囊中段隆突区存在大量干细胞,其中也包括神经嵴干细胞（human epidermal neural crest stem cells,hEPI-NCSCs）。人们推测,经过不断的增殖、迁移和分化,hEPI-NCSCs可逐渐转化为黑素细胞。因此,hEPI-NCSCs可能在白癜风的复色中起着重要的作用,进一步探索hEPI-NCSCs的特点可为白癜风的复色提供更多的理论基础。毛囊由两部分组成:上皮组织和结缔组织,呈囊状。由外向内依次是结缔组织鞘、外毛根鞘和内毛根鞘。在结构上,以皮脂腺开口和立毛肌附着点为界可将其分为三部分:漏斗部、隆突部和毛球部。国外的研究证实,毛囊外毛根鞘隆突区存在hEPI-NCSCs,可以表达SOX10、Nestin、MSX2、ETS-1等多种干细胞的标记。且具有干细胞特有的自我更新、增殖、多能分化等特点。我们前期研究已在细胞水平证实白癜风患者毛囊隆突区存在hEPI-NCSCs,并具有迁移能力和增殖活性,经特定的诱导剂诱导可分化为黑素细胞、软骨细胞和施万细胞等。为了进一步探讨308nm紫外线治疗白癜风的机制及白癜风的复色机制,本课题组构建了人毛发毛囊单位裸鼠移植模型,并以308nm紫外线照射,观察毛囊隆突不同时间点的hEPI-NCSCs数量。旨在探明白癜风患者毛囊周围型复色模式的机制以及光疗对hEPI-NCSCs的影响,并为以hEPI-NCSCs治疗白癜风提供理论支撑。材料与方法1、标本取自于我院整形外科、烧伤毛发移植科等外伤或局部瘢痕的患者,标本为拟毛发移植的手术患者经FUE毛发提取器获取的毛发毛囊单位或含有一定数量毛囊的头皮组织。所选患者的入选标准为:（1）年龄18～40岁,性别不限;（2）毛囊单位结构完整;（3）局部无免疫性、色素性、感染性等疾病者;（4）近1个月内毛囊局部无用药史。排除标准:（1）局部毛发细软或局部毛囊周围炎等毛发疾病者;（2）毛囊结构不完整者。所有患者均签署知情同意书。2、在超净工作台内,将获取的头皮组织或毛囊单位以生理盐水冲洗,采用剪刀沿毛囊生长方向修剪标本,毛发移植镊和22号大圆刀片去除毛囊周围多余的脂肪和结缔组织,将上述组织分离成完整的单根毛发毛囊单位备用。3、采用2%的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉裸鼠,以输液贴将裸鼠固定于压舌板上,2.5ml注射器的针头以倾斜的方式在裸鼠背部戳孔,然后采用毛发移植镊植入完整毛发毛囊单位,表皮外毛干长度均为2mm。将构建好的毛发毛囊单位裸鼠移植模型随机分为实验组和对照组。4、观察裸鼠背部植入毛发生长情况:每周采用数码相机拍摄裸鼠背部植入毛发的存活、生长情况;每周计数裸鼠背部植入毛发存活率、毛干长度,并观察是否有新的毛发长出。两周后开始为实验组的小鼠进行308nm紫外线照射,隔日一次,直至实验结束为止。5、光照结束后以颈椎脱臼法处死裸鼠,取下移植部位的皮肤,用大圆刀片将毛囊分离出来,固定并制备成石蜡切片。采用免疫组化的方法检测不同光照时间点毛囊隆突SOX10、Nestin阳性细胞数并统计分析。结果1.移植的毛发毛囊单位两周存活率约为80%,其中对照组存活率为（80.33±2.15）%,实验组为（80.07±1.01）%,两组存活率差异无统计学意义（P=0.729）。毛干平均每周增长1.56±0.59mm,两组毛干长度差异无统计学意义（P值均＞0.05）。从第3周开始,毛干开始出现折断的情况,折断的部位在距毛根0.5～2mm左右处,实验期间未曾见到新的毛发长出。2.hEPI-NCSCs的标记SOX10和Nestin在对照组和光照组均有阳性表达。在对照组,SOX10阳性标记在胞核,Nestin阳性标记在胞浆;在光照组,SOX10阳性标记在胞核,Nestin阳性标记在胞浆和毛球部。3.308nm紫外线照射后,SOX10阳性细胞数多于对照组（t=3.808,P=0.019）;Nestin 阳性细胞数多于对照组（t=6.045,P=0.004）。4.随着光照次数的增加,SOX10阳性细胞数较前增加,且有统计学意义（t=7.316,P=0.018）;Nestin 阳性细胞数较前增加,且有统计学意义（t=14.084,P=0.005）。结论1.成功构建人毛发毛囊单位裸鼠移植模型。2.308nm紫外线照射人毛发毛囊单位裸鼠移植模型后,hEPI-NCSCs的数量增加,且随光疗次数增加而增加。