【摘 要】
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大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917,EcN）是德国生理学家Alfred Nissle从疫区一名未感染痢疾的士兵粪便中分离的一株益生菌。该益生菌株具有鞭毛系统,鞭毛由基底部、鞭毛钩和鞭毛丝三部分构成,其中鞭毛丝是鞭毛的主体结构,由成千拷贝的鞭毛蛋白（Flagellin,FliC）组装而成。目前的研究表明,FliC由D0、D1、D2和D3四个基本结
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大肠杆菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917,EcN）是德国生理学家Alfred Nissle从疫区一名未感染痢疾的士兵粪便中分离的一株益生菌。该益生菌株具有鞭毛系统,鞭毛由基底部、鞭毛钩和鞭毛丝三部分构成,其中鞭毛丝是鞭毛的主体结构,由成千拷贝的鞭毛蛋白（Flagellin,FliC）组装而成。目前的研究表明,FliC由D0、D1、D2和D3四个基本结构域组成,D0和D1构成FliC的保守区,是FliC佐剂效应发挥的结构基础,主要负责TLR5信号通路激活;D2和D3结构域为FliC的高变区,是FliC的抗原决定区域,主要负责鞭毛抗原的抗原性,研究者们对高变区域在FliC佐剂活性的贡献上存有分歧。FliC的佐剂活性越来越受到关注,但特异性抗体反应会干扰含有相同鞭毛蛋白类佐剂疫苗的重复使用,这是该类佐剂亟待解决的一个关键性问题;并且不同血清型菌株的FliC序列各不相同,佐剂活性也存在差异。我们选择益生菌来源的FliCEcN,其包含595个氨基酸,与沙门氏菌和其他共生大肠杆菌相比,具有更长的高变区。目的:基于FliCEcN具有抗原性和佐剂活性的双重性质,获得更具效应的FliCEcN佐剂,为明确FliCEcN不同区域对佐剂效应的影响及探究FliCEcN新型免疫佐剂奠定基础。方法:以益生菌EcN的鞭毛蛋白(FliCEcN)为切入点,针对其高变区,进行不同区域的缺失,构建出FliC△174-506和FliC△274-406突变体,首先测定各FliCEcN的抗原性与免疫原性;随后使用Caco-2细胞系,检测各FliC体外诱导IL-8的分泌水平;最后选用禽白血病病毒衣壳蛋白P27为模式抗原,以滴鼻途径免疫小鼠,比较各FliC诱导小鼠针对P27特异性免疫应答的能力。结果:（1）生物学活性:经原核表达、纯化及去除内毒素的FliCEcN、FliC△174-506和FliC△274-406均能刺激Caco-2分泌IL-8,相比FliCEcN组,FliC△274-406组诱导Caco-2分泌IL-8的能力差异不显著（p>0.05）,而FliC△174-506组显著增强了Caco-2分泌IL-8的水平（p<0.05）。（2）抗原性:两种缺失变体FliC△1 7 4-5 0 6和FliC△274-406都显示出对全长FliC的抗原性显著降低（p<0.05）,均降低25倍。（3）免疫原性:FliCEcN、FliC△174-506和FliC△274-406组均能刺激产生FliCEcN、FliC△174-506和FliC△274-406特异性血清抗体;与FliCEcN组相比,FliC△174-506组的特异性血清抗体水平显著降低（p<0.05）,FliC△274-406组的特异性血清抗体水平极显著降低（p<0.01）;FliC△174-506组和FliC△274-406组间差异不显著。（4）佐剂活性:所有组别唾液中均未检测出P27特异性Ig A抗体;与P27组相比,P27+FliCEcN、P27+FliC△174-506和P27+CTB组P27特异性血清Ig G抗体水平显著增强（p<0.05）;P27+FliCEcN、P27+FliC△1 7 4-50 6、P27+CTB组诱导较高P27特异性血清Ig G抗体,比P27+FliC△274-406组增高至少200倍;P27+FliCEcN组和P27+FliC△174-506组诱导P27特异性血清抗体水平相同,与P27+CTB组之间针对P27特异性血清抗体水平差异不显著。结论:FliCEcN高变区缺失的两个突变体FliC△174-506和FliC△274-406,均降低了对FliCEcN的抗原性,以及诱导对应特异性抗体的免疫原性;FliC△174-506诱导P27特异性血清Ig G的水平与FliCEcN相同,有望用作改善免疫特性的鞭毛蛋白类佐剂。
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