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背景与目的:变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是特应性个体接触过敏原后由Ig E介导的以发作性喷嚏、清水样涕和鼻塞为主要症状的I型变态反应性疾病,其发病基础为以Th2炎性反应为主的Th1/Th2/Th17/Treg免疫失衡。AR影响全球多达40%人口且病情容易反复,可继发鼻-鼻窦炎、支气管哮喘和中耳炎等多种疾病,已经严重影响人们工作、心理健康和生活质量并造成沉重的社会负担。临床上约20%AR患者药物治疗（激素类药物、抗组胺、抗白三烯药物）疗效尚不理想,过敏原特异性免疫疗法虽可对因治疗,但仍面临疗效、安全性、病人依从性及相对成本效益问题。桔皮素（tangeretin）是来源于柑橘类果皮的O型聚甲氧黄酮类物质,可选择性抑制Notch1信号,具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤等多种功效。然而桔皮素对AR的作用及具体机制目前尚不明确,本研究拟探讨桔皮素与Treg细胞的关系及其对AR动物模型的治疗作用,为AR潜在治疗提供新的策略和方向。本研究分为三个部分:第一部分Notch1-Jagged1在AR患者血清中的表达研究目的:探究AR患者血清Notch信号相关受体及配体的表达水平及其与过敏严重程度的关系。研究方法:1.收集武汉大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科2018年7月-11月期间AR患者血清103例及正常对照血清101例,利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测AR组及对照组血清Notch1、Jagged1及DLL1表达。2.将AR患者过敏原筛查结果1-3级归为轻度过敏组（AR-mild）,4-6级归为重度过敏组（AR-severe）,分析比较轻度过敏组与重度过敏组Notch1、Jagged1表达差异。3.单独分析屋尘螨（或粉尘螨）轻度过敏组与重度过敏组Notch1、Jagged1表达差异。4.利用Pearson相关系数对AR患者血清Notch1、Jagged1表达与s Ig E水平进行相关性分析。结果:1.AR患者血清中Notch1及Jagged1表达明显高于非AR的对照血清（P0.05）。2.AR患者重度过敏组受试者血清中Notch1及Jagged1表达明显高于轻度过敏组（P<0.05）。3.屋尘螨（或粉尘螨）过敏患者重度过敏组受试者血清中Notch1及Jagged1表达明显高于屋尘螨（或粉尘螨）轻度过敏组（P<0.05）。4.AR患者血清Notch1、Jagged1表达与s Ig E水平呈显著正相关（Notch1:r=0.7106,P<0.01;Jagged1:r=0.6361,P<0.01）。结论:AR患者血清Notch1-Jagged1显著增高;其表达与过敏的严重程度呈显著正相关趋势。第二部分桔皮素抑制Notch1/Jagged1促进Treg分化的作用及对AR动物模型的治疗作用研究目的:探究桔皮素对AR动物模型是否具有显著的治疗作用及其具体作用机制。研究方法:将SPF级C57BL/6J小鼠随机分为4组并进行相应的造模及治疗处理（10只/组）:分别为正常对照组、AR组、桔皮素组及地塞米松组（阳性对照）。1.比较各组小鼠过敏症状评分;利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测各组小鼠血清OVA-s Ig E滴度;利用苏木精-伊红（HE）染色法及过碘酸-希夫（PAS）染色法分别检测鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润情况及杯状细胞增生分泌情况。2.利用流式多重液相蛋白定量技术（CBA）检测各组小鼠脾脏淋巴细胞培养上清中Th1/Th2/Th17相关细胞因子浓度。3.利用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析各组实验动物脾脏组织中Notch信号通路相关蛋白（Notch1、Notch2、Jagged1）及Treg细胞关键转录因子Foxp3表达水平差异。4.利用流式细胞术检测各组实验动物脾脏组织中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例变化。结果:1.与正常对照组比较,AR小鼠鼻部症状学评分及血清OVA-s Ig E表达显著上调,并伴有鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润增加、杯状细胞异常增生和分泌（P<0.05）;与AR组比较,桔皮素及地塞米松处理组均显著减轻AR小鼠症状学评分、降低血清OVA-s Ig E滴度并缓解鼻黏膜嗜酸性粒细胞浸润情况及杯状细胞异常增生分泌等一系列病理变化（P<0.05）。2.与正常对照组比较,AR小鼠IL-6、IL-10、IL-17A显著增高而IFN-γ、IL-2明显下降（P<0.05）;与AR组比较,桔皮素组IL-6、IL-10及IL-17A表达下降而IFN-γ表达上升（P<0.05）,桔皮素可显著纠正AR小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子失衡。3.与正常对照组比较,AR小鼠Notch1、Jagged1表达显著升高而Notch2、Foxp3表达显著下降;与AR组比较,桔皮素组Notch1、Jagged1表达下调而Foxp3表达上升（P0.05）。4.与正常对照组比较,AR小鼠CD4+CD25+FOXP3+Treg比例明显降低（P<0.05）;与AR组比较,桔皮素组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例显著上升（P0.05）。结论:桔皮素通过特异性抑制Notch1/Jagged1而不影响Notch2的表达从而促进Treg细胞分化并减轻变应性鼻炎发生发展。第三部分桔皮素通过抑制CD4+T细胞表面Notch1表达促进Treg细胞增殖分化研究目的:探究桔皮素促进Treg细胞增殖分化的分子机制。研究方法:1.取8-12周龄SPF级C57BL/6J小鼠脾脏利用磁珠分选获得其CD4+CD25-T淋巴细胞进行体外Treg诱导培养,摸索Treg细胞体外最适培养条件。2.不同浓度桔皮素（0μM、4μM、10μM、18μM）处理后,流式细胞术检测各组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例变化;RT-q PCR检测细胞Notch1、Foxp3表达差异;Pearson相关系数对Notch1及Foxp3的表达进行相关性分析。结果:1.CD4+CD25-T细胞在anti-CD3（10μg/m L）、anti-CD28（1μg/m L）、IL-2（15ng/m L）、TGF-β（10ng/m L）刺激条件体外培养3天,Treg分化比例可高达78.5%;而在anti-CD3（10μg/m L）、anti-CD28（1μg/m L）、IL-2（10ng/m L）、TGF-β（8ng/m L）刺激条件体外培养3天,Treg分化比例最低为34.8%。2.与0μM组比较,随着桔皮素处理浓度的增高,CD4+T淋巴细胞的Notch1表达逐渐下降（P<0.05）;CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例及其关键转录因子Foxp3表达逐渐升高（P<0.05）;Notch1与Foxp3表达具有显著负性相关趋势（r=0.869,P<0.05）。结论:在一定浓度范围内,桔皮素呈剂量依赖性抑制CD4+T细胞表面Notch1表达从而促进Treg增殖分化。总之,本研究证实AR患者血清Notch1-Jagged1高表达,并且与过敏的严重程度呈显著正相关趋势;在AR动物模型中,桔皮素通过特异性抑制Notch1/Jagged1而不影响Notch2的表达从而促进FOXP3+Treg细胞分化并减轻变应性鼻炎发生发展;体外环境下桔皮素呈剂量依赖性抑制CD4+T细胞表面Notch1表达从而促进Treg增殖分化。综上我们得出结论:桔皮素抑制Notch1/Jagged1信号促进Treg细胞分化减轻变应性鼻炎发生发展。