论文部分内容阅读
一、mTOR信号通路通过自噬途径调节寨卡病毒复制
1.背景
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于蚊媒传播病原体，感染机体能引起寨卡病毒病，多表现为发热，皮疹，关节痛等轻微症状。2016年，ZIKV在美洲、东南亚等地区再次爆发流行，感染患者出现新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)等严重神经系统并发症，引起全世界关注。ZIKV属于黄病毒科、黄病毒属，为单股正链RNA病毒，其基因组约为11kb，可编码一个多聚蛋白，在宿主或病毒蛋白酶的作用下，剪切形成3种结构蛋白和7种非结构(non-structural，NS)蛋白。现有研究表明，ZIKV可以感染多种类型细胞并能在靶细胞内有效复制。然而，对ZIKV感染早期与宿主细胞间的相互作用机制了解有限，难以实现病毒疫情的有效防控和寨卡病毒病的诊治。
细胞自噬是溶酶体对细胞内长寿蛋白质、受损细胞器等进行分解代谢的过程，以维持细胞自稳态。在病毒感染时，自噬能降解胞内受损细胞器保证细胞存活，抵抗病毒感染，如单纯疱疹病毒；但是，登革病毒、丙肝病毒等却能逃避宿主细胞诱导的自噬监测和清除，并利用自噬来促进自身复制。自噬调节通路复杂，最主要的是哺乳动物雷帕霉素靶标(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路。mTOR分子是自噬诱导剂雷帕霉素的作用靶点，能形成两种复合物mTORC1和mTORC2。mTORC1是自噬调节核心因子，抑制mTORC1能激活ULK1、Beclin-1，促使自噬前体膜结构的产生，启动自噬；mTORC1还能调控下游靶分子S6K和4E-BP促进蛋白质合成。mTORC2能使AKT发生磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路。TSC2受上游调节因子AKT、AMPK、MAPK等调节，TSC2磷酸化能抑制mTORC1活性。而AMPK、Bcl-2等还可以不依赖mTORC1，直接作用Beclin-1，调节自噬。自噬启动时，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-I)酯化为LC3-II，是自噬早期标志蛋白。前期研究发现，ZIKV的NS4A和NS4B蛋白在感染胎儿神经干细胞过程，会通过mTOR信号通路激活自噬，引起神经系统损伤。因此，ZIKV感染诱导自噬与病毒生命周期的作用机制需要深入研究。
蚊媒传播的ZIKV引起全身性病毒感染，需要ZIKV透过血管内皮细胞进入血液循环系统传播，并突破血脑屏障造成神经系统损伤。本课题首先研究ZIKV感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC)对自噬的诱导，通过自噬抑制剂和siRNA干扰自噬过程，探讨细胞自噬对病毒复制的影响。为进一步探讨自噬核心分子mTOR与ZIKV的相互作用，课题还精准干扰mTOR信号通路分子，研究mTOR信号通路在ZIKV感染过程对自噬诱导以及对病毒复制的影响。
2.方法
含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的慢病毒感染HUVEC，随后感染ZIKV，共聚焦显微镜观察胞内LC3荧光蛋白表达，探讨ZIKV感染HUVEC是否激活自噬。不同滴度ZIKV感染HUVEC，免疫印迹法检测不同感染时间内源性蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化以及P62蛋白的表达，共聚焦显微镜观察统计细胞内LC3蛋白不同颜色荧光点数量变化，分析ZIKV感染HUVEC诱导的自噬流水平。采用自噬抑制剂渥曼青霉素和氯喹处理细胞，或者shRNA敲低细胞自噬基因Beclin-1表达，感染ZIKV，免疫印迹法和空斑法探讨抑制自噬对ZIKV复制的影响。再采用自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞，感染ZIKV，免疫印迹法和空斑法探讨诱导自噬对ZIKV复制的影响。接下来围绕雷帕霉素作用靶点mTOR分子展开研究，免疫印迹法检测在ZIKV感染后12和18小时mTOR信号通路分子的表达。采用雷帕霉素及其衍生物(依维莫司、替西罗莫司)或者siRNA敲低mTOR表达，直接作用于mTOR分子；或采用siRNA敲低mTORC1、mTORC2特定组分Raptor、Rictor表达，作用于mTOR不同复合物；或采用AKT激活剂SC79或者siRNA敲低TSC2、AMPK表达，作用于mTORC1上游因子：感染ZIKV，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法探讨mTOR信号通路分子对病毒复制的影响。含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的HUVEC感染ZIKV，运用共聚焦显微镜直观地观察干扰mTOR信号通路分子对ZIKV诱导细胞自噬的影响。
3.结果
ZIKV感染或者自噬诱导剂雷帕霉素使细胞内LC3荧光点数量和表达LC3荧光蛋白的阳性细胞数量显著增加。LC3-II在ZIKV感染细胞后18和24小时表达升高，持续到36小时；P62蛋白在感染后12小时开始表达下降，48小时降至最低；共聚焦显微镜发现在ZIKV感染细胞后18至24小时，含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的HUVEC中绿色或黄色荧光点(自噬体)减少，而红色荧光点(自噬溶酶体)增多。自噬抑制剂渥曼青霉素能降低LC3-Ⅱ蛋白表达和胞外子代病毒含量；自噬抑制剂氯喹提高LC3-Ⅱ蛋白表达，但能降低病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量；敲低Beclin-1蛋白能降低病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量。自噬诱导剂雷帕霉素能提高LC3-Ⅱ蛋白表达，但是不影响病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量。ZIKV感染HUVEC，降低mTOR磷酸化水平，上游TSC2和AMPK磷酸化水平升高，而AKT磷酸化水平降低；调控蛋白翻译的下游分子S6K和4E-BP1磷酸化水平下降；而调控自噬的ULK1(S757)磷酸化水平升高，Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达升高。雷帕霉素及其衍生物、simTOR直接作用mTOR分子只能提高胞内病毒RNA含量约2.5倍，不影响病毒蛋白NS1表达和胞外子代病毒含量。敲低mTORC1或mTORC2特定组分Raptor或Rictor能增加病毒蛋白NS1表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量。干扰mTORC1上游分子发现，siTSC2与SC79降低病毒蛋白NS1表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量。共聚焦显微镜观察发现，敲低AMPK，细胞LC3荧光点数量没有变化；敲低TSC2或者激活AKT，细胞LC3荧光点数量减少；敲低Rictor、Raptor、mTOR或者雷帕霉素处理，细胞LC3荧光点数量增加。
4.结论
ZIKV感染HUVEC能诱导自噬且自噬流通畅，抑制自噬能降低病毒的蛋白表达和组装释放。然而，雷帕霉素激活自噬不影响病毒的蛋白表达和组装释放。ZIKV感染HUVEC抑制AKT/TSC2/mTORC1信号通路，上调ULK1复合物活性以及Beclin-1和LC3II表达，从而增强自噬；使S6K和4E-BP1去磷酸化，阻碍蛋白翻译。细胞自噬能促进ZIKV复制，同时病毒蛋白表达受细胞mTOR信号通路调控。本课题阐明了细胞自噬在ZIKV生命周期中的作用机制，以及ZIKV感染HUVEC过程中mTOR信号通路调控蛋白合成与自噬诱导的双重功能，并为基于mTOR信号通路自噬调节相关分子研制高效抗ZIKV药物的潜在应用提供了理论依据。
二、PTEN调控脂质代谢促进登革病毒复制
1.背景
登革病毒(Dengue virus，DENV)属于蚊媒传播病原体，引发的登革热疫情波及热带和亚热带地区。DENV感染患者临床症状多样，可以表现为无症状，轻微症状，和危及生命的出血热或登革热休克综合征。DENV属于黄病毒科、黄病毒属，单股正链RNA病毒，能编码多聚蛋白，并剪切成3种结构蛋白和7种非结构蛋白。目前尚无有效的抗DENV药物和疫苗，部分原因是对DENV与宿主间的相互作用了解有限。
抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)编码的蛋白质具有蛋白磷酸酶与脂质磷酸酶双重酶活性，能拮抗PI3K，阻断AKT通路，调节脂质代谢。病毒感染能劫持细胞脂质代谢过程，以脂滴(Lipid drops，LDs)作为病毒组装场所，促进病毒自身复制；还能消耗LDs等脂质，进行β-氧化，为病毒复制提供能量。本课题利用PTEN磷酸酶突变形式慢病毒，研究在DENV感染Huh7过程，PTEN磷酸酶活性对脂质代谢和细胞自噬的调节，以及对病毒复制和组装的影响。
2.方法
DENV-2感染Huh7细胞，免疫印迹法和QRT-PCR检测病毒感染对PTEN表达的影响。过表达PTEN和PTENshRNA的慢病毒感染细胞，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法检测过表达或者敲低PTEN对病毒复制的影响。PTEN磷酸酶突变形式慢病毒(脂质磷酸酶活性缺失突变体G129E、蛋白磷酸酶活性缺失突变体Y138L、两种磷酸酶活性缺失突变体C124S)感染细胞，再感染DENV-2，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法检测PTEN磷酸酶活性对病毒复制的影响。采用DENVNS3抗体和油红O分别染色细胞内病毒蛋白和LDs，共聚焦显微镜观察PTEN的磷酸酶活性在病毒感染过程对脂质代谢的影响。免疫印迹法检测PTEN下游AKT信号通路分子、脂质合成相关酶、自噬相关蛋白LC3的表达。
3.结果
DENV-2感染Huh7细胞，免疫印迹法发现PTEN蛋白表达下降，但是QRT-PCR结果显示PTENmRNA水平不变。PTEN过表达能提高病毒蛋白NS3表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量，而敲低PTEN表达具有相反的作用效果。野生型PTEN和Y138L突变体能提高病毒蛋白NS3表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量，而G129E和C124S突变体不影响。共聚焦显微镜观察发现DENV感染会减少胞内LDs面积与数量；与感染细胞相比，野生型PTEN和Y138L突变体使胞内LDs面积与数量减少，而G129E和C124S突变体不影响。免疫印迹法结果发现野生型PTEN和Y138L突变体使AKT磷酸化水平下降，FoxO1与Maf1蛋白表达升高，而脂肪合成相关酶表达下降，LC3-Ⅱ表达升高，PTENshRNA与之相反，而G129E和C124S突变体不影响。
4.结论
DENV感染通过转录后途径下调PTEN蛋白表达。PTEN的脂质磷酸酶活性通过调节AKT/FoxO1/Maf1信号通路和增强自噬，造成脂质消耗和LDs减少，促进病毒自身的复制。这有助于阐明PTEN与脂质代谢在DENV感染和复制过程的相互作用机制，并为抗DENV治疗提供了新思路。
1.背景
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)属于蚊媒传播病原体，感染机体能引起寨卡病毒病，多表现为发热，皮疹，关节痛等轻微症状。2016年，ZIKV在美洲、东南亚等地区再次爆发流行，感染患者出现新生儿小头畸形、格林-巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)等严重神经系统并发症，引起全世界关注。ZIKV属于黄病毒科、黄病毒属，为单股正链RNA病毒，其基因组约为11kb，可编码一个多聚蛋白，在宿主或病毒蛋白酶的作用下，剪切形成3种结构蛋白和7种非结构(non-structural，NS)蛋白。现有研究表明，ZIKV可以感染多种类型细胞并能在靶细胞内有效复制。然而，对ZIKV感染早期与宿主细胞间的相互作用机制了解有限，难以实现病毒疫情的有效防控和寨卡病毒病的诊治。
细胞自噬是溶酶体对细胞内长寿蛋白质、受损细胞器等进行分解代谢的过程，以维持细胞自稳态。在病毒感染时，自噬能降解胞内受损细胞器保证细胞存活，抵抗病毒感染，如单纯疱疹病毒；但是，登革病毒、丙肝病毒等却能逃避宿主细胞诱导的自噬监测和清除，并利用自噬来促进自身复制。自噬调节通路复杂，最主要的是哺乳动物雷帕霉素靶标(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路。mTOR分子是自噬诱导剂雷帕霉素的作用靶点，能形成两种复合物mTORC1和mTORC2。mTORC1是自噬调节核心因子，抑制mTORC1能激活ULK1、Beclin-1，促使自噬前体膜结构的产生，启动自噬；mTORC1还能调控下游靶分子S6K和4E-BP促进蛋白质合成。mTORC2能使AKT发生磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路。TSC2受上游调节因子AKT、AMPK、MAPK等调节，TSC2磷酸化能抑制mTORC1活性。而AMPK、Bcl-2等还可以不依赖mTORC1，直接作用Beclin-1，调节自噬。自噬启动时，微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3-I)酯化为LC3-II，是自噬早期标志蛋白。前期研究发现，ZIKV的NS4A和NS4B蛋白在感染胎儿神经干细胞过程，会通过mTOR信号通路激活自噬，引起神经系统损伤。因此，ZIKV感染诱导自噬与病毒生命周期的作用机制需要深入研究。
蚊媒传播的ZIKV引起全身性病毒感染，需要ZIKV透过血管内皮细胞进入血液循环系统传播，并突破血脑屏障造成神经系统损伤。本课题首先研究ZIKV感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC)对自噬的诱导，通过自噬抑制剂和siRNA干扰自噬过程，探讨细胞自噬对病毒复制的影响。为进一步探讨自噬核心分子mTOR与ZIKV的相互作用，课题还精准干扰mTOR信号通路分子，研究mTOR信号通路在ZIKV感染过程对自噬诱导以及对病毒复制的影响。
2.方法
含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的慢病毒感染HUVEC，随后感染ZIKV，共聚焦显微镜观察胞内LC3荧光蛋白表达，探讨ZIKV感染HUVEC是否激活自噬。不同滴度ZIKV感染HUVEC，免疫印迹法检测不同感染时间内源性蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化以及P62蛋白的表达，共聚焦显微镜观察统计细胞内LC3蛋白不同颜色荧光点数量变化，分析ZIKV感染HUVEC诱导的自噬流水平。采用自噬抑制剂渥曼青霉素和氯喹处理细胞，或者shRNA敲低细胞自噬基因Beclin-1表达，感染ZIKV，免疫印迹法和空斑法探讨抑制自噬对ZIKV复制的影响。再采用自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞，感染ZIKV，免疫印迹法和空斑法探讨诱导自噬对ZIKV复制的影响。接下来围绕雷帕霉素作用靶点mTOR分子展开研究，免疫印迹法检测在ZIKV感染后12和18小时mTOR信号通路分子的表达。采用雷帕霉素及其衍生物(依维莫司、替西罗莫司)或者siRNA敲低mTOR表达，直接作用于mTOR分子；或采用siRNA敲低mTORC1、mTORC2特定组分Raptor、Rictor表达，作用于mTOR不同复合物；或采用AKT激活剂SC79或者siRNA敲低TSC2、AMPK表达，作用于mTORC1上游因子：感染ZIKV，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法探讨mTOR信号通路分子对病毒复制的影响。含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的HUVEC感染ZIKV，运用共聚焦显微镜直观地观察干扰mTOR信号通路分子对ZIKV诱导细胞自噬的影响。
3.结果
ZIKV感染或者自噬诱导剂雷帕霉素使细胞内LC3荧光点数量和表达LC3荧光蛋白的阳性细胞数量显著增加。LC3-II在ZIKV感染细胞后18和24小时表达升高，持续到36小时；P62蛋白在感染后12小时开始表达下降，48小时降至最低；共聚焦显微镜发现在ZIKV感染细胞后18至24小时，含mTagRFP-mWasabi-LC3报告质粒的HUVEC中绿色或黄色荧光点(自噬体)减少，而红色荧光点(自噬溶酶体)增多。自噬抑制剂渥曼青霉素能降低LC3-Ⅱ蛋白表达和胞外子代病毒含量；自噬抑制剂氯喹提高LC3-Ⅱ蛋白表达，但能降低病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量；敲低Beclin-1蛋白能降低病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量。自噬诱导剂雷帕霉素能提高LC3-Ⅱ蛋白表达，但是不影响病毒蛋白NS3表达和胞外子代病毒含量。ZIKV感染HUVEC，降低mTOR磷酸化水平，上游TSC2和AMPK磷酸化水平升高，而AKT磷酸化水平降低；调控蛋白翻译的下游分子S6K和4E-BP1磷酸化水平下降；而调控自噬的ULK1(S757)磷酸化水平升高，Beclin-1和LC3Ⅱ蛋白表达升高。雷帕霉素及其衍生物、simTOR直接作用mTOR分子只能提高胞内病毒RNA含量约2.5倍，不影响病毒蛋白NS1表达和胞外子代病毒含量。敲低mTORC1或mTORC2特定组分Raptor或Rictor能增加病毒蛋白NS1表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量。干扰mTORC1上游分子发现，siTSC2与SC79降低病毒蛋白NS1表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量。共聚焦显微镜观察发现，敲低AMPK，细胞LC3荧光点数量没有变化；敲低TSC2或者激活AKT，细胞LC3荧光点数量减少；敲低Rictor、Raptor、mTOR或者雷帕霉素处理，细胞LC3荧光点数量增加。
4.结论
ZIKV感染HUVEC能诱导自噬且自噬流通畅，抑制自噬能降低病毒的蛋白表达和组装释放。然而，雷帕霉素激活自噬不影响病毒的蛋白表达和组装释放。ZIKV感染HUVEC抑制AKT/TSC2/mTORC1信号通路，上调ULK1复合物活性以及Beclin-1和LC3II表达，从而增强自噬；使S6K和4E-BP1去磷酸化，阻碍蛋白翻译。细胞自噬能促进ZIKV复制，同时病毒蛋白表达受细胞mTOR信号通路调控。本课题阐明了细胞自噬在ZIKV生命周期中的作用机制，以及ZIKV感染HUVEC过程中mTOR信号通路调控蛋白合成与自噬诱导的双重功能，并为基于mTOR信号通路自噬调节相关分子研制高效抗ZIKV药物的潜在应用提供了理论依据。
二、PTEN调控脂质代谢促进登革病毒复制
1.背景
登革病毒(Dengue virus，DENV)属于蚊媒传播病原体，引发的登革热疫情波及热带和亚热带地区。DENV感染患者临床症状多样，可以表现为无症状，轻微症状，和危及生命的出血热或登革热休克综合征。DENV属于黄病毒科、黄病毒属，单股正链RNA病毒，能编码多聚蛋白，并剪切成3种结构蛋白和7种非结构蛋白。目前尚无有效的抗DENV药物和疫苗，部分原因是对DENV与宿主间的相互作用了解有限。
抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)编码的蛋白质具有蛋白磷酸酶与脂质磷酸酶双重酶活性，能拮抗PI3K，阻断AKT通路，调节脂质代谢。病毒感染能劫持细胞脂质代谢过程，以脂滴(Lipid drops，LDs)作为病毒组装场所，促进病毒自身复制；还能消耗LDs等脂质，进行β-氧化，为病毒复制提供能量。本课题利用PTEN磷酸酶突变形式慢病毒，研究在DENV感染Huh7过程，PTEN磷酸酶活性对脂质代谢和细胞自噬的调节，以及对病毒复制和组装的影响。
2.方法
DENV-2感染Huh7细胞，免疫印迹法和QRT-PCR检测病毒感染对PTEN表达的影响。过表达PTEN和PTENshRNA的慢病毒感染细胞，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法检测过表达或者敲低PTEN对病毒复制的影响。PTEN磷酸酶突变形式慢病毒(脂质磷酸酶活性缺失突变体G129E、蛋白磷酸酶活性缺失突变体Y138L、两种磷酸酶活性缺失突变体C124S)感染细胞，再感染DENV-2，免疫印迹法、QRT-PCR和空斑法检测PTEN磷酸酶活性对病毒复制的影响。采用DENVNS3抗体和油红O分别染色细胞内病毒蛋白和LDs，共聚焦显微镜观察PTEN的磷酸酶活性在病毒感染过程对脂质代谢的影响。免疫印迹法检测PTEN下游AKT信号通路分子、脂质合成相关酶、自噬相关蛋白LC3的表达。
3.结果
DENV-2感染Huh7细胞，免疫印迹法发现PTEN蛋白表达下降，但是QRT-PCR结果显示PTENmRNA水平不变。PTEN过表达能提高病毒蛋白NS3表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量，而敲低PTEN表达具有相反的作用效果。野生型PTEN和Y138L突变体能提高病毒蛋白NS3表达、胞内病毒RNA含量和胞外子代病毒含量，而G129E和C124S突变体不影响。共聚焦显微镜观察发现DENV感染会减少胞内LDs面积与数量；与感染细胞相比，野生型PTEN和Y138L突变体使胞内LDs面积与数量减少，而G129E和C124S突变体不影响。免疫印迹法结果发现野生型PTEN和Y138L突变体使AKT磷酸化水平下降，FoxO1与Maf1蛋白表达升高，而脂肪合成相关酶表达下降，LC3-Ⅱ表达升高，PTENshRNA与之相反，而G129E和C124S突变体不影响。
4.结论
DENV感染通过转录后途径下调PTEN蛋白表达。PTEN的脂质磷酸酶活性通过调节AKT/FoxO1/Maf1信号通路和增强自噬，造成脂质消耗和LDs减少，促进病毒自身的复制。这有助于阐明PTEN与脂质代谢在DENV感染和复制过程的相互作用机制，并为抗DENV治疗提供了新思路。