乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）是一种经蚊媒传播的重要的人畜共患病病原。该病毒属于黄病毒科黄病毒属,对多种动物易感,人感染后出现明显的脑炎症状,猪感染以繁殖障碍性疾病为主。JEV NS1’蛋白是通过核糖体移码产生的一种非结构蛋白,该类蛋白仅存在于黄病毒属乙脑血清群中,与病毒的神经侵袭力有关。我们之前的研究发现JEV NS1’蛋白能够通过靶向miR-22抑制MAVS介导的Ⅰ型干扰素（IFN-I）产生,进而增强病毒血症,提高JEV入侵脑组织的病毒载量。但JEV NS1’蛋白如何调控miR-22的表达仍不清楚。基于此,本研究通过筛选与JEV NS1’蛋白互作的宿主蛋白,深入研究其调控miR-22表达的分子机制,具体内容如下:1.JEV NS1’蛋白单克隆抗体的制备我们克隆表达了JEV NS1’52aa（核糖体移码产生NS1’蛋白特有的52个氨基酸）,利用纯化的蛋白免疫4周龄的Balb/C小鼠,通过融合及亚克隆技术,最终得到2株杂交瘤细胞株:3D11和4H1,均能稳定分泌与JEV NS1’52aa蛋白结合的抗体。将筛选出来的NS1’蛋白单抗进行特异性验证,发现这两株单抗均只识别JEV NS1’蛋白,并不识别JEV NS1蛋白,这为深入研究JEV NS1’蛋白功能提供了重要抗体材料。2.JEV NS1’蛋白调控miR-22表达的分子机制我们之前的研究发现JEV NS1’蛋白能够通过靶向miR-22抑制MAVS介导的IFN-I产生,但在该过程中,miR-22调控的MAVS通路是否发挥主导作用?通过MAVS-/-小鼠的体内实验或者在Hela细胞上敲低MAVS（或miR-22）后发现,当MAVS（或miR-22）被敲低后JEV NS1’蛋白抑制IFN-β的能力被完全消除,说明JEV NS1’蛋白主要通过靶向miR-22-MAVS通路来降低IFN-β的产生。为了进一步探究JEV NS1’蛋白如何调控miR-22的表达,我们构建了miR-22启动子的双荧光素报告系统,并利用该系统证实转录因子CREB和c-Rel能够直接结合到miR-22的启动子区域上,进而调控miR-22的转录。此外,通过进行染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验,证明JEV NS1’蛋白不能直接与miR-22的启动子区域结合,但可以间接增强CREB和c-Rel与miR-22启动子区域的结合,进而上调miR-22的表达。3.参与NS1’蛋白调控miR-22转录的宿主互作蛋白筛选及验证为了进一步探究NS1’蛋白如何增强CREB和c-Rel与miR-22启动子区域的结合,我们通过亲和层析法结合质谱分析,利用JEV NS1’蛋白单克隆抗体,在感染JEV的Hela细胞中筛选到可能与JEV NS1’蛋白互作的宿主蛋白。将筛选的蛋白通过免疫共沉淀进行验证,发现宿主蛋白周期素依赖性激酶1（CDK1）与JEV NS1’蛋白互作,但不与JEV NS1蛋白互作。为了验证筛选的CDK1蛋白是否参与miR-22的转录,我们在Hela细胞中过表达CDK1或抑制CDK1功能,结果证实:CDK1正向调控miR-22的转录及表达。4.JEV NS1’蛋白与CDK1蛋白的互作机制及其对miR-22转录的影响为了进一步确认JEV NS1’蛋白是否通过与CDK1蛋白互作来增强miR-22的转录,我们在Hela细胞中抑制CDK1功能后,发现JEV NS1’蛋白上调miR-22表达的能力被解除;同时JEV感染结果表明,在CDK1功能被抑制的情况下,NS1’缺失毒及其亲本毒株诱导IFN-β的差异及病毒增殖差异也均被解除,说明CDK1是JEV NS1’蛋白上调miR-22表达的关键互作蛋白。接下来我们通过Ch IP及Western blot验证了CDK1能够促进CREB与c-Rel的入核,增强miR-22的转录,进而抑制MAVS介导IFN-β的产生。在此基础上,我们利用CDK1抑制剂RO3306在体内感染模型上进一步探究CDK1蛋白对JEV复制的调控作用。结果显示:当CDK1被抑制后,JEV在小鼠体内的增殖明显降低,JEV感染引起的小鼠发病及死亡明显减弱;但在MAVS-/-小鼠中,抑制CDK1并不影响JEV在小鼠体内的复制。本研究首次揭示了CDK1蛋白在JEV NS1’调控miR-22-MAVS-IFN-β通路中扮演重要角色,初步阐明了JEV NS1’通过与CDK1互作来诱导miR-22表达,并进一步调控I型干扰素表达的分子机制,揭示了CDK1在JEV复制中的关键作用,为探究JEV免疫逃逸机制提供了新思路。