水牛是世界第二大产奶家畜,具有较强的抗病能力和耐粗饲性特点,适应湿热气候,非常适合在我国南方地区饲养,有利于解决我国南方地区鲜奶相对缺乏的困境。水牛奶的乳脂率和干物质含量远高于荷斯坦牛奶,享有“奶中黄金”的美誉。然而,水牛产奶量低严重制约其发展。因此,筛选鉴定调控水牛泌乳性状的功能基因尤其重要。本课题组前期对水牛泌乳性状进行全基因组关联分析研究（GWAS）,发现MFSD14A基因是调控水牛乳脂率和乳蛋白率的候选基因,然而该基因在调控水牛乳脂合成过程中所发挥的具体功能及分子机制尚不清晰。已知MFSD14A基因属于主要促进因子（MFS）超家族成员。MFS家族蛋白多发挥膜转运功能,已发现多个MFS蛋白与奶牛泌乳性状相关。因此,本研究以MFS蛋白为研究对象,先进行基因家族鉴定、进化关系分析、表达规律分析和关联分析等,筛选出该家族中对水牛奶乳脂含量影响最大的基因,然后应用体外细胞实验,探究该基因在乳脂合成过程中的作用及机制,为开展水牛分子育种及遗传改良提供理论依据。本研究共包括四部分实验:实验一:基于MFS超家族理论分析水牛MFSD14A基因调控乳脂性状的功能。本实验从全基因组水平上对水牛MFS家族蛋白进行鉴定,共得到36个MFS基因以及86条MFS蛋白质序列。亚细胞定位显示,这些蛋白全部定位于细胞膜及各种细胞器膜上;利用MEME搜索和NCBI-CCD搜索对水牛MFS蛋白的基序和结构域进行鉴定分析,共得到15个基序,并证明这些基序主要属于MFS超家族,发挥膜转运功能;基于MUSCLE比对,构建水牛、奶牛、山羊、绵羊和马的MFS蛋白进化树,分析其进化关系,并通过染色体定位与共线性分析,发现水牛与奶牛的MFS蛋白Ka/Ks均小于1,说明MFS蛋白在水牛和奶牛中发挥着相似的作用;应用GO和KEGG进行富集分析,发现水牛MFS基因主要发挥膜转运功能;进行标记-性状关联分析,发现大量位于MFS基因内且与水牛泌乳性状显著关联的分子标记,位于MFSD14A基因内的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）与水牛乳脂率和乳蛋白率极显著关联,且不同基因型个体的性状差异较大,据此推测MFSD14A通过调节跨膜转运功能调节水牛乳脂性状。实验二:RNAi干扰MFSD14A基因对乳腺上皮细胞增殖和功能的影响。为了鉴定MFSD14A基因的功能,应用RNAi技术干扰该基因在水牛和奶牛乳腺上皮细胞中的表达,发现乳腺上皮细胞的周期受到显著影响,表现为G0/G1期细胞显著减少,G2/M期的细胞显著增多,甘油三酯含量都显著降低,调控乳脂合成的基因如ACSL1、ACSS2、FABP3和SCD的表达量显著降低,但细胞内乳蛋白含量无显著变化;利用气相色谱检测干扰MFSD14A基因后水牛乳腺上皮细胞内的脂肪酸含量,发现细胞内棕榈酸、硬脂酸和油酸的含量极显著降低30%以上;在培养基中添加棕榈酸、硬脂酸和油酸之后,细胞内甘油三酯的含量显著上升。在干扰MFSD14A的同时添加这三种脂肪酸,与仅干扰MFSD14A基因相比,细胞内甘油三酯含量有所回升,细胞培养液上清中棕榈酸、硬脂酸和油酸含量显著高于对照组,说明干扰该基因之后进入细胞内的脂肪酸显著减少。实验三:过表达MFSD14A基因对乳腺上皮细胞增殖和功能的影响。为了进一步鉴定MFSD14A基因的功能,构建了MFSD14A基因表达载体并进行瞬时转染,发现在过表达该基因之后,乳腺上皮细胞的周期受到了显著的影响,S期的细胞显著减少,G2/M期的细胞显著增多;在单独过表达该基因时,细胞内甘油三酯的含量无显著变化,ACSL1、FABP3、SCD等基因的表达量也无显著变化,但在添加棕榈酸和硬脂酸后,过表达MFSD14A后细胞内甘油三酯的含量相比对照组显著上升,调控乳脂合成的基因如FABP3、ACSL1等的表达量也显著上调,即在过表达MFSD14A基因的同时添加脂肪酸作为底物才能促进乳腺上皮细胞合成甘油三酯。实验四:MFSD14A基因调控水牛乳腺上皮细胞乳脂合成和细胞周期机制。对干扰MFSD14A基因后的水牛乳腺上皮细胞进行m RNA测序,发现642个下调基因和362个上调基因;对差异表达基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,发现这些基因主要富集在DNA复制、细胞周期和PPAR信号通路。PPAR信号通路中的SLC27A6显著上调,FABP3、FABP4、ACOX2等基因的表达量显著下调。综上,基于基因组水平家族分析、蛋白结构分析及标记-性状关联分析,筛选出MFSD14A基因是调控水牛乳脂性状的重要基因;经体外细胞实验,发现该基因可以调控乳腺上皮细胞长链脂肪酸的转运摄取;经转录组测序,发现该基因通过PPAR信号通路调控乳腺上皮细胞乳脂的合成。