第一部分TMEM16A在压力超负荷型肥厚心肌病理机制中的作用背景:Ca2+、Ca2+依赖的转录因子、Ca2+依赖的酶、Ca2+稳态相关的蛋白（主要是离子通道蛋白和转运蛋白）在正常心脏和疾病心脏重塑及电重塑中具有非常重要的作用,作为Ca2+激活Cl-通道（calcium-activated chloride channels,Ca CCs）,Ca CCs的激活情况与胞内Ca2+相关,生理或病理条件下Ca2+稳态直接影响Ca CCs转运Cl-的功能。Ca CCs在心脏早期后除极（early after depolarization,EAD）、延迟后除极（delay after depolarization,DAD）和心律失常中可能作用的研究有了一些报道,囊性纤维化跨膜转导调节因子（cystic fibrosis transmembraneconductance regulator,CFTR）和电压门控Cl-通道3（ClC-3）这两种Cl-通道与心脏肥厚和心衰的研究也有了一些报道,Ca2+稳态异常是肥厚和心衰心肌细胞的特征性标志,但有关Ca CCs与心脏肥厚和心衰的报道非常有限,且结论不一致。目的:建立并评估小鼠压力超负荷型左心室肥厚模型,通过检测左心室肥厚发生发展过程中跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A,TMEM16A,是一种Ca CCs）在分子表达水平和电生理特征上的变化,探究TMEM16A在左心室肥厚心脏重塑和肥厚心肌细胞电重塑中可能的作用。方法:使用8-10周雄性野生（wild type,WT）C57BL/6小鼠,在头臂干和左颈总动脉之间结扎（缩窄）,形成主动脉缩窄（aortic banding,AB）以建立小鼠压力超负荷型左心室肥厚模型,假手术（Sham）小鼠作为对照组。在术前（0周）和术后12周内,每周进行一次超声心动图测定,以评估左心室肥厚的发生和发展。通过实时定量PCR和Western blot、Wes实验,检测小鼠左心室肥厚发生发展过程中TMEM16A的mRNA和蛋白表达水平的变化。通过全细胞膜片钳实验,检测小鼠左心室肥厚发生发展过程中左心室肌细胞TMEM16A全细胞电流密度的变化;动作电位持续时间（action potential duration,APD）的变化;TMEM16A电流对APD的影响。结果:1.（1）与Sham组相比,AB组小鼠在术后1周,左心室壁厚度、左心室质量和质量指数均出现显著增加,提示在主动脉压力超负荷（左心室收缩期后负荷增加）的情况下,左心室肌总量发生了代偿性的增加,左心室肥厚发生。（2）从术后1到12周,AB组小鼠左心室质量和质量指数均随时间增长而持续增高,且显著高于Sham组,说明左心室肥厚持续发展。（3）AB组小鼠左心室壁厚度在术后6周左右达到最大值后,从第7周到第12周,与第6周相比,左心室壁厚度持续降低,第12周AB组小鼠的左心室壁厚度显著低于Sham组;AB组小鼠左心室腔内径从第8周开始持续增高、显著高于Sham组。模型建立6-8周之后出现左心室壁变薄、左心室腔扩大现象,提示左心室肌可能发生失代偿。（4）AB组小鼠在术后7到12周左心室短轴缩短分数显著减小,术后9到12周左心室射血分数显著减小,均提示AB组小鼠的左心室肌收缩功能在第7周之后显著减弱。（5）术后12周内两组之间的左心室每搏输出量和心输出量均没有显著差异,说明主动脉缩窄后左心室肌仍可维持正常水平的心排血量。2.主动脉缩窄诱导小鼠左心室肥厚发生发展过程中,左心室肌的TMEM16A mRNA和蛋白表达水平无显著变化。3.将T16Ainh-A01（TMEM16A通道特异性抑制剂）敏感的瞬时外向电流(transient outward current,Ito)峰值电流定义为ITMEM16A,在本实验的电压钳条件下,主动脉缩窄诱导小鼠左心室肥厚发生发展过程中,左心室肌细胞的ITMEM16A密度无显著变化。4.压力超负荷型左心室肥厚小鼠在后期（第8周及之后）左心室肌细胞APD显著延长。5.抑制TMEM16A电流对AB组（心脏肥厚发展各阶段）或Sham组小鼠的左心室肌细胞APD无显著影响。结论:1.采用主动脉缩窄法建立了小鼠压力超负荷型左心室肥厚模型,通过超声心动图测定,确认该动物模型建立成功。2.TMEM16A蛋白具有不同的剪接异构体,具有种属特异性和组织特异性,作为功能性膜蛋白还有糖基化等翻译后修饰,可能存在辅助亚基,其分子量并非固定为预测的114 k Da。3.小鼠左心室肥厚发生发展过程中,左心室肌的TMEM16A分子表达水平和全细胞电流密度均无显著变化。4.TMEM16A电流是左心室肌细胞Ito的组成成分,但并不是压力超负荷型左心室肥厚小鼠左心室肌细胞APD延长的主要原因。5.暂无证据表明TMEM16A在小鼠左心室肥厚心脏重塑和肥厚心肌细胞电重塑中有直接贡献。第二部分TMEM16A在内皮细胞血管生成中的作用背景:心脏肥厚反应要求心脏血管生成以缓解缺氧和维持心肌收缩功能,增强血管生成是改善缺血心肌局部血流和心肌功能的可行、有效的策略,同时也是对其它缺血性疾病进行血运重建的治疗策略,但目前没有被批准临床应用的药剂或血管生成疗法;抑制血管生成,是治疗癌症、眼、关节或皮肤病等过度血管生成相关疾病的策略。血管内皮细胞是形成新血管分支的关键,大多数内皮细胞（如小鼠内皮细胞）难以在3D培养物中保持,而人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）是血管生成相关实验最常用的细胞模型之一。TMEM16A在癌细胞和血管平滑肌细胞的增殖、迁移方面有不少研究报道,并且没有一致的结论。仅有几篇关于TMEM16A与血管内皮细胞的报道,发现TMEM16A在不同来源、不同状态内皮细胞中表现的作用并不一致,但TMEM16A与内皮细胞的凋亡、增殖、迁移及内皮功能障碍等有关,因此可以合理假设TMEM16A在血管生成中起作用,目前没关于TMEM16A与血管生成的报道。压力超负荷型心脏肥厚属于高血压性心脏肥厚,血管生成参与其病理发展。体外培养细胞实验无法给予细胞高压刺激,可通过血管紧张素II（angiotensin II,Ang II）诱导模拟高压环境。目的与方法:以血管内皮细胞的常用模式细胞HUVECs为实验细胞,分别使用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转录后目的基因沉默法和慢病毒转染目的基因过表达法获得TMEM16A敲低和过表达的HUVECs,通过细胞培养伤口愈合实验评估HUVECs迁移,通过内皮细胞管形成实验和内皮细胞球状体出芽实验评估HUVECs血管生成,探究（1）TMEM16A的表达量对HUVECs迁移和血管生成的影响;（2）在Ang II模拟的高压环境下,TMEM16A的表达量对HUVECs的迁移和血管生成的影响;（3）TMEM16A的表达量对经典的促血管生成的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）功能的影响;（4）以TMEM16A的Ca2+激活Cl-通道功能为切入点,使用TMEM16A通道特异性药理学工具,研究TMEM16A的通道活性在HUVECs迁移和血管生成中的作用。结果:1.25、50和100 n M抗TMEM16A的3种siRNA（#1、#2和#3 siRNA）转染均显著降低HUVECs的TMEM16A mRNA相对表达水平,并且#1、#2和#3 siRNA均以剂量依赖方式下调TMEM16A mRNA的表达。2.100 n M#1、#2和#3 siRNA及其等比例混合物（equal proportion mixture of 3kinds of siRNAs against TMEM16A,siRNA Mix）转染均显著降低HUVECs的TMEM16A mRNA相对表达水平;100 MOI小鼠源TMEM16A过表达慢病毒(Lentivirus which can induce TMEM16A overexpression,LVOE)转染显著增高HUVECs的TMEM16A mRNA相对表达水平。3.100 n M#1、#2、#3 siRNA和siRNA Mix转染均显著降低HUVECs的TMEM16A蛋白相对表达水平;100 MOI LVOE转染显著增高HUVECs的TMEM16A蛋白相对表达水平。4.siRNA Mix转染的HUVECs,伤口闭合百分比显著降低,提示TMEM16A敲低可抑制HUVECs迁移;成管的总分支长度和球状体出芽总长度显著降低,提示TMEM16A敲低可抑制HUVECs的血管生成;TMEM16A敲低可增强Ang II的抑HUVECs迁移和抑血管生成作用;TMEM16A敲低可减弱VEGF的促HUVECs迁移和促血管生成作用。5.LVOE转染的HUVECs,伤口闭合百分比显著增高,提示TMEM16A过表达可促进HUVECs迁移;成管的总分支长度和球状体出芽总长度显著增高,提示TMEM16A过表达可促进HUVECs的血管生成;TMEM16A过表达可减弱Ang II的抑HUVECs迁移和抑血管生成作用;TMEM16A过表达可增强VEGF的促HUVECs迁移和促血管生成作用。6.TMEM16A通道特异性激活剂Eact和抑制剂T16Ainh-A01,对HUVECs的迁移和血管生成无显著影响,提示TMEM16A对HUVECs迁移和血管生成的正调节作用独立于TMEM16A的Cl-转运功能。结论:1.TMEM16A敲低抑制HUVECs的迁移和血管生成,过表达促进HUVECs的迁移和血管生成,TMEM16A是HUVECs迁移和血管生成的正调节因素。2.Ang II模拟高压环境下,HUVECs的迁移和血管生成功能受抑制,TMEM16A敲低可增强该抑制作用,TMEM16A过表达可减弱该抑制作用。3.TMEM16A是VEGF促HUVECs迁移和血管生成作用的正调节因素。4.TMEM16A通道活性变化对HUVECs迁移和血管生成无显著影响。5.TMEM16A可能成为治疗血管生成相关疾病的新的潜在靶点。