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背景与目的食管癌（Esophageal Cancer,EC）是消化系统中常见的恶性肿瘤,在全世界因癌症而导致死亡的原因中排名第二位。EC是一种发病率高、预后不良,同时具有强浸润性的肿瘤。EC包括两种重要病理类型:食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma,EAC）和食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）。食管腺癌在西方国家比较多见,而食管鳞状细胞癌是发展中国家的主要病理类型。由于EC的发病率上升和预后不良,因此有必要寻找新颖的EC早期诊断参数和方法。因此,更好地了解EC致癌的分子机制对于改善EC的诊断,个人治疗和预后至关重要。尽管已报道了许多与EC相关的癌基因和抑癌基因,但尚未完全阐明EC肿瘤发生的生物学功能和潜在机制。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,IncRNA）是一类具有200个核苷酸的非编码RNA,没有明显的蛋白质编码潜能。但是,最近的研究表明IncRNA在基因组中无处不在,在许多疾病中都发挥着关键作用,尤其与肿瘤发生有关。lncRNA在某些癌症中特异性表达,因此认为lncRNA是新型的潜在生物标志物和癌症治疗靶标。我们课题组前期研究表明lncRNAXLOC001659在食管鳞癌中高表达,查阅国内外文献目前关于lncRNAXLOC001659的报道非常少,我们的研究第一次综合分析了其在食管鳞癌中的表达和生物学作用。miRNA是在真核生物中发现的一类小分子非编码RNA,它们是由22-24个核苷酸组成。研究发现,miRNA在很多肿瘤中参与调节,充当抑癌基因或者癌基因的作用。miR-490-5p对多种肿瘤有抑制作用,包括乳腺癌等,但其在食管癌中的作用尚未明确。众所周知,lncRNA和miRNA可以相互作用,参与调控不同的癌症,与肿瘤相关的miRNAs和lncRNAs可能被开发为特异性的癌症生物标志物,用于癌症的诊断预后监测等。本研究探索了 lncRNAXLOC001659对食管鳞癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响,并探讨其潜在分子机制。方法1.收集食管正常上皮细胞HET-1A和食管鳞癌细胞EC9706、EC-1,提取RNA进行逆转录。2.应用 qRT-PCR 检测 HET-1A 和 EC9706、EC-1 中 lncRNAXLOC001659的表达。3.合成敲低lncRNAXLOC001659的siRNA和无关序列对照组NC,转染EC9706 和 EC-1 细胞后,得到下调 lncRNA XLOC001659 表达的 EC9706 和 EC-1细胞。4.应用qRT-PCR验证转染siRNA和NC后EC9706和EC-1细胞中lncRNA XLOC 001659 的表达。5.CCK-8和平板克隆形成实验检测下调lncRNA XLOC001659的表达对EC9706和EC-1细胞增殖能力的影响。6.Transwell实验用来检测下调lncRNA XLOC001659的表达对EC9706和EC-1细胞侵袭能力的影响。7.细胞划痕实验检测下调lncRNA XLOC001659的表达后,EC9706和EC-1细胞的迁移能力。8.Hoechst 33342 染色检测下调 lncRNAXLOC001659 的表达对 EC9706 和EC-1细胞凋亡的影响。9.采用生物信息学分析与lncRNAXLOC001659相互作用的miRNA。10.根据生物信息学分析结果,应用qRT-PCR检测下调EC9706和EC-1中lncRNAXLOC001659的表达对miR-490-5p的表达的影响。11.构建lncRNA XLOC001659野生型和突变型载体,应用双荧光素酶报告实验进一步验证lncRNAXLOC001659和miR-490-5p的相互作用。12.将 miR-490-5p mimics 转染进 EC9706 和 EC-1 细胞,制备 miR-490-5p过表达的EC9706和EC-1细胞,Transwell和平板克隆实验检测上调miR-490-5p的表达对食管鳞癌细胞系侵袭和增殖的影响。13.采用生物信息学分析与miR-490-5p相互作用的靶基因。14.构建PIK3CA野生型和突变型载体,应用双荧光素酶报告验证PIK3CA是miR-490-5p的靶基因。15.应用Western-blot检测上调miR-490-5p的表达后PIK3CA的表达水平。16.回复实验检测过表达PIK3CA对食管鳞癌细胞系增殖和侵袭的影响。结果1.qRT-PCR结果显示lncRNA XLOC001659在食管鳞癌细胞EC9706和EC-1的表达显著高于在食管正常上皮细胞HET-1A中的表达。2.qRT-PCR结果显示和无关序列对照组相比,转染siRNA的EC9706和EC-1细胞中IncRNAX]LOC001659的表达显著低于对照组。3.CCK-8实验结果显示转染siRNA的EC9706和EC-1细胞与NC对照组相比,其生长在24h后受到显著抑制,并随时间的延长而日益显著。4.平板克隆形成实验结果显示对比无关序列对照组,转染siRNA的EC9706和EC-1细胞形成克隆数显著低于NC对照组。5.Transwell侵袭实验结果显示转染siRNA组细胞侵袭数与无关序列对照组相比有显著性差异。6.细胞划痕实验结果显示转染siRNA组细胞的迁移能力与无关序列对照组相比,在Oh无显著差异,24h和48h细胞迁移能力减弱。7.Hoechst 33342染色实验结果显示转染siRNA组细胞和转染无关序列对照组细胞相比,差异并不显著（P>0.05）。8.生物信息学分析结果显示,lncRNA XLOC001659和miR-490-5p存在相互作用的seed region区特异结合位点。位于chr2:126754156-126754172。9.qRT-PCR 结果显示下调 EC9706 和 EC-1 细胞中 lncRNA XLOC001659的表达,miR-490-5p的表达显著增加。10.双荧光素酶报告结果显示共转染miR-490-5p mimics和野生型lncRNA XLOC001659重组报告载体,食管鳞癌细胞系荧光素酶活性明显降低,共转染miR-490-5p mimics和突变型lncRNAXLOC001659 重组报告载体,食管鳞癌细胞系的荧光素酶活性没有明显差异。11.平板克隆形成实验显示转染miR-490-5p mimics的食管鳞癌细胞系克隆形成数明显减少,与对照组相比。12.过表达食管鳞癌细胞系中的miR-490-5p后,Transwell结果显示食管鳞癌细胞系侵袭数明显减少。13.生物信息学分析结果显示,miR-490-5p和PIK3CA存在相互作用的seed region区结合位点。14.双荧光素酶报告结果显示共转染miR-490-5p mimics和野生型PIK3CA重组报告载体,食管鳞癌细胞系荧光素酶活性明显降低,共转染miR-490-5p mimics和突变型PIK3CA重组报告载体,以及转染有miR-490-5p NC和重组载体细胞的荧光素酶活性没有明显差异。15.Western-blot结果显示与无关序列对照组相比,过表达miR-490-5p后显著抑制了 PIK3CA蛋白的表达。16.过表达PIK3CA后,Transwell实验结果显示侵袭数明显增加,平板克隆形成实验结果显示食管鳞癌细胞系克隆形成数明显增加。结论1.与食管正常上皮细胞HET-1A相比,lncRNAXLOC001659在食管鳞癌EC9706和EC-1细胞中的表达显著升高。2.下调食管鳞癌EC9706和EC-1细胞中的lncRNAXLOC001659的表达显著抑制了食管鳞癌细胞系的增殖和侵袭。3.PIK3CA是miR-490-5p的下游作用靶点之一,食管鳞癌中lncRNA XLOC001659对增殖和侵袭的作用分子机制可能部分是由于其通过调控miR-490-5p的表达,进而影响PIK3CA的表达,发挥其生物学作用。