自体皮片移植是治疗皮肤创伤的传统方法，但自体皮源不足是大面积创伤救治过程中的难题。组织工程皮肤的发展为解决这类难题提供了新的思路。而组织工程真皮在皮肤重建过程中具有重要的作用，其可增强创面愈合后的皮肤弹性、柔韧性及机械耐磨性，减少瘢痕增生，控制挛缩。有的组织工程真皮中加入了活性成纤维细胞可促进表皮生长分化，诱导基底膜形成，对促进创面的愈合具有重要作用。目前已研制了多种组织工程真皮产品且部分商品经美国FDA批准用于临床。但是对面积较大的的创面，组织工程皮肤移植成功率及修复效果均不稳定。缺乏血管样结构为其主要的影响因素。因为组织工程真皮种子细胞的分裂、增殖均需要充足的营养和氧气，即充足的血液供应。所以提高组织工程真皮的血管化对改善其移植成活率及修复效果具有重要的意义。 本研究从构建组织工程所用的种子细胞、支架材料两方面出第四军医大学硕士学位论文发对组织工程真皮的血管化问题进行了一定的研究。实验分三部分进行，具体内容如下: 第一部分通过对构建组织工程真皮所需要的种子细胞的研究来改善组织工程真皮的血管化问题。选用了血管内皮细胞以及转染有VEGF基因的皮肤成纤维细胞来构建含血管样结构的组织工程真皮。实验一血管内皮细胞的培养与鉴定本实验以新生SD仔鼠肺组 织为细胞来源，采用组织块法进行血管内皮细胞原代培养， 并进一步用本实验室设计的纯化方法对其进行纯化和传代培 养。通过形态学、免疫组织化学、透射电镜对其进行鉴定。 结果显示通过本方法可以获得状态较好、纯度较高的血管内 皮细胞。实验二血管内皮细胞与皮肤成纤维细胞体外共培养的研究将 实验一获得的血管内皮细胞与SD仔鼠皮肤成纤维细胞按一 定的比例混合后于体外共培养。结果发现在不需要任何支架 材料及外源性生长因子条件下就可以形成大量的管腔样结 构。本实验为组织工程产品血管化提供了新的思路。实验三含血管样结构组织工程真皮的构建实验组为将转染有 VEGF基因成纤维细胞与血管内皮细胞按1:1比例混合接种 到胶原凝胶中;对照组为皮肤成纤维细胞与血管内皮细胞按 1:1比例接种到胶原凝胶中制备组织工程真皮。对实验组与 对照组所构建的组织工程真皮中血管样结构形成的数量、形 态等进行比较。结果显示两者无差别。第四军医大学硕士学位论文 第二部分为优选出利于血管化的组织工程真皮支架材料。实验中选用3种支架材料，通过比较挑选出性能更好的利于血管化的真皮支架。实验一组织工程真皮支架的制备制备2种膜状的真皮支架， 一种选用天然材料胶原和壳聚糖，将其按一定的比例混合后 真空冻干制备成膜状材料。另一种选用人工合成材料PLGA， 应用盐溶法制作泡沫状材料。扫描电镜观察两种材料的孔隙 率均达到85%以上，且孔隙相互贯通。但PLGA泡沫状材料 孔隙分布更均匀一点。结果显示两种支架均可用作构建组织 工程真皮细胞生长的载体。实验二不同支架材料构建组织工程真皮的制备将皮肤成纤维 细胞种植到实验一制备的支架以及胶原凝胶真皮支架上，培 养一段时间后，经HE染色、透射电镜观察、拉伸强度的测定 及细胞生长曲线的绘制对不同材料进行比较，结果显示三种 支架均可用于构建组织工程真皮，细胞相容性较好，均能支 持皮肤成纤维细胞正常的生长和代谢。胶原一壳聚糖冻干膜支 架较胶原凝胶、PLGA支架为更好的可促进血管化的组织工程 真皮支架。 第三部分主要对组织工程种子细胞的转归问题进行初步探讨。采用荧光染料对种子细胞进行标记，然后用标记的细胞构建组织工程真皮，通过荧光显微镜及HE染色观察，在一定的移植部位，标记的细胞在一定时间内仍然具有被激发后发光的特性，本实验为研究组织工程真皮种子细胞的转归及进一步了解组织工程真皮第四军医大学硕士学位论文种子细胞的命运提供了一定基础。