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目的:本研究通过检测不同剂量的扶正祛邪复方中药含药血清(FCS)联合化疗药物处理后的K562/A02细胞株MDR1mRNA、P-gp、P65表达,探讨扶正祛邪复方中药含药血清对K562/A02细胞NF-κB信号基因表达的影响,进一步探索扶正祛邪复方中药含药血清逆转白血病多药耐药可能的分子生物学机制。
方法:1.细胞培养与传代:RPMI1640培养基(含5%胎牛血清)培养K562和K562/A02细胞,培养条件为37℃和5%CO2。在细胞处于对数生长期时进行实验,每3天进行一次细胞传代换液;
2.配制扶正祛邪复方中药:扶正祛邪复方由人参、黄芪、麦冬、青黛、五味子、白花蛇舌草六味中药组成,由贵阳中医学院第二附属医院制剂室制备。
3.制备FCS:15只新西兰大白兔随机分为3组,按低剂量组3g/kg灌服中药液,中剂量组6g/kg灌服中药液,高剂量组12g/kg灌服中药液,每日一次,共10天,末次灌药2小时后在无菌条件下腹主动脉取血并分离血清,过滤除菌后备用。
4.MTT法检测细胞耐药倍数、逆转倍数及抑制率:采用MTT法分别检测加入不同浓度FCS后K562、K562/A02的吸光度变化,计算K562细胞、K562/A02细胞的耐药倍数、逆转倍数及相应抑制率,进一步观察不同浓度FCS对K562细胞及K562/A02细胞增殖的影响;
5.Western blot方法检测NF-κB/P-gp及NF-κB/P65表达,并通过Rt-PCR检测MDR1mRNA。
结果:1.细胞耐药倍数的测定:K562、K562/A02细胞在不同浓度的培养液中培养72h后,自动酶标仪检测细胞株K562的IC50(半数抑制浓度)值为0.604±0.05μg/ml,K562/A02的IC50值为24.45±1.32μg/ml,耐药倍数(RF)=39.81,即K562/A02的耐药倍数为39.81倍。
2.不同剂量FCS对K562/A02细胞耐药倍数(RF)的影响:高剂量组的逆转倍数为27.94;中剂量组的逆转倍数为11.85;低剂量组的逆转倍数为4.98.
3.不同剂量含药血清对K562细胞、K562/A02细胞抑制率的影响:不同剂量的含药血清均能够抑制K562、K562/A02细胞的增殖,且抑制作用与剂量相关,各组之间存在统计学差异(P<0.05)。
4.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中mRNA MDR1的影响:不同剂量的含药血清均能够降低K562/A02细胞内mRNA MDR1的浓度。各组耐药细胞内mRNA MDR1的浓度为:高剂量组(HD)<干扰素组(IFN)<中剂量组(MD)<低剂量组(LD)<空白组(BP),其中HD组、MD组、LD组及IFN组与BP组.比较均具有统计学差异(P<0.05),HD组分别与MD组、LD组比较均具有统计学差异(P<0.05);LD组与IFN组比较有统计学差异(P<0.05);MD组与IFN组、LD组比较具有统计学意义(P<0.05)。
5.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中P-gp表达的影响:不同剂量的含药血清均能够降低P-gp的表达。各组蛋白表达率为:HD组<IFN组<MD组<LD组<BP组。LD组、MD组、HD组、IFN组分别与BP组比较,均具有统计学差异(P<0.05)。
6.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中P65表达的影响:不同剂量的含药血清均能够降低P65的表达。各组蛋白表达率为:HD组<IFN组<MD组<LD组<BP组。LD组、MD组、HD组、IFN组分别与BP组比较,均具有统计学差异(P<0.05)。
结论:1.扶正祛邪复方中药含药血清一定程度上具有抑制K562、K562/A02细胞增殖的作用;
2.扶正祛邪复方中药含药血清可下调P-gp、P65的表达;
3.扶正祛邪复方中药含药血清可下调NF-κB通路MDR1mRNA的表达。
4.扶正祛邪复方中药含药血清能够一定程度上逆转耐白血病细胞多药耐药,其逆转作用可能与下调P65、P-gp及MDR1mRNA的表达有关。
方法:1.细胞培养与传代:RPMI1640培养基(含5%胎牛血清)培养K562和K562/A02细胞,培养条件为37℃和5%CO2。在细胞处于对数生长期时进行实验,每3天进行一次细胞传代换液;
2.配制扶正祛邪复方中药:扶正祛邪复方由人参、黄芪、麦冬、青黛、五味子、白花蛇舌草六味中药组成,由贵阳中医学院第二附属医院制剂室制备。
3.制备FCS:15只新西兰大白兔随机分为3组,按低剂量组3g/kg灌服中药液,中剂量组6g/kg灌服中药液,高剂量组12g/kg灌服中药液,每日一次,共10天,末次灌药2小时后在无菌条件下腹主动脉取血并分离血清,过滤除菌后备用。
4.MTT法检测细胞耐药倍数、逆转倍数及抑制率:采用MTT法分别检测加入不同浓度FCS后K562、K562/A02的吸光度变化,计算K562细胞、K562/A02细胞的耐药倍数、逆转倍数及相应抑制率,进一步观察不同浓度FCS对K562细胞及K562/A02细胞增殖的影响;
5.Western blot方法检测NF-κB/P-gp及NF-κB/P65表达,并通过Rt-PCR检测MDR1mRNA。
结果:1.细胞耐药倍数的测定:K562、K562/A02细胞在不同浓度的培养液中培养72h后,自动酶标仪检测细胞株K562的IC50(半数抑制浓度)值为0.604±0.05μg/ml,K562/A02的IC50值为24.45±1.32μg/ml,耐药倍数(RF)=39.81,即K562/A02的耐药倍数为39.81倍。
2.不同剂量FCS对K562/A02细胞耐药倍数(RF)的影响:高剂量组的逆转倍数为27.94;中剂量组的逆转倍数为11.85;低剂量组的逆转倍数为4.98.
3.不同剂量含药血清对K562细胞、K562/A02细胞抑制率的影响:不同剂量的含药血清均能够抑制K562、K562/A02细胞的增殖,且抑制作用与剂量相关,各组之间存在统计学差异(P<0.05)。
4.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中mRNA MDR1的影响:不同剂量的含药血清均能够降低K562/A02细胞内mRNA MDR1的浓度。各组耐药细胞内mRNA MDR1的浓度为:高剂量组(HD)<干扰素组(IFN)<中剂量组(MD)<低剂量组(LD)<空白组(BP),其中HD组、MD组、LD组及IFN组与BP组.比较均具有统计学差异(P<0.05),HD组分别与MD组、LD组比较均具有统计学差异(P<0.05);LD组与IFN组比较有统计学差异(P<0.05);MD组与IFN组、LD组比较具有统计学意义(P<0.05)。
5.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中P-gp表达的影响:不同剂量的含药血清均能够降低P-gp的表达。各组蛋白表达率为:HD组<IFN组<MD组<LD组<BP组。LD组、MD组、HD组、IFN组分别与BP组比较,均具有统计学差异(P<0.05)。
6.不同剂量含药血清对K562/A02细胞中P65表达的影响:不同剂量的含药血清均能够降低P65的表达。各组蛋白表达率为:HD组<IFN组<MD组<LD组<BP组。LD组、MD组、HD组、IFN组分别与BP组比较,均具有统计学差异(P<0.05)。
结论:1.扶正祛邪复方中药含药血清一定程度上具有抑制K562、K562/A02细胞增殖的作用;
2.扶正祛邪复方中药含药血清可下调P-gp、P65的表达;
3.扶正祛邪复方中药含药血清可下调NF-κB通路MDR1mRNA的表达。
4.扶正祛邪复方中药含药血清能够一定程度上逆转耐白血病细胞多药耐药,其逆转作用可能与下调P65、P-gp及MDR1mRNA的表达有关。