目的:道地药材的质量形成是环境与遗传互作的结果。龙胆为我省道地药材,目前国内和国际市场对龙胆的需求量巨大,具课题组前期研究发现各产地之间同时期的龙胆形态及生长环境均差异显著,导致质量也参差不齐,探讨产地主要环境因子对龙胆植株性状和品质的影响,为龙胆药材的野生抚育、优良品种培育提供依据,同时有利于龙胆药材种质资源保护和道地性研究。同时本实验结合省内龙胆的分布信息及质量评价指标,基于Max Ent模型和Arc GIS软件相结合的方式进行分布适宜性区划以及品质区划研究,分析生态因子对龙胆生长分布和有效成分含量的影响,探讨生态因子对道地药材形成的影响,明确龙胆道地药材形成的环境动力,并且以龙胆质量为依据进行产区划分。遗传多样性分析理清辽宁省龙胆的亲缘关系,分析遗传因素对龙胆质量的影响,研究龙胆道地性形成的遗传机制,对道地药材龙胆的野生抚育、合理引种提供理论依据。最后结合环境与遗传因子互作探讨道地药材形成机制。材料与方法:1.材料:本课题实验在辽宁龙胆主要产区进行实地采样,共获取23批龙胆采样点信息,均为三年生龙胆,样品经辽宁中医药大学尹海波教授鉴定为龙胆Gentiana scabra Bge.。使用手持GPS定位仪获取并记录各产地相应的经纬度和海拔,并通过中药资源空间信息网格数据库（http://www.tcm-resources.com/）以及中国气象科学数据共享服务网数据查询系统（http://data.cma.cn/data）获取相应气象资料,《中药资源空间信息网格数据库》包含气候、土壤、地形和植被类型等生态因子数据。2.方法2.1不同产地相同生长年限龙胆各10株,洗净去除泥沙杂质,测定株高、茎秆数、主茎粗、茎生中叶长、茎生中叶宽、花序长、花序宽、花序数、根茎长、根茎直径、根茎鲜重、根茎干重、折干率13个指标。用卷尺和数显卡尺测量植株性状指标,待完全干燥后称量根茎干重并计算地下部分折干率。对得出的数据进行数据分析。2.2采用HPLC法测定龙胆中龙胆苦苷,獐牙菜苦苷,獐牙菜苷以及龙胆碱的含量,采用紫外分光光度计测定龙胆多糖的含量,评价龙胆药材质量。2.3基于Max Ent模型和Arc GIS软件相结合进行分布适宜性区划以及品质区划研究。分析影响龙胆适宜性分布的主要生态因子,及其对龙胆有效成分的影响,基于区划结果对辽宁省龙胆产区进行分级并规划最优产区。2.4应用单因素试验和正交试验相结合的方法优化ISSR-PCR的反应体系,并根据PCR结果进行遗传多样性分析。2.5本研究通过分析遗传因子对龙胆质量的影响以及环境因子与遗传因子关联分析对龙胆道地性形成的影响,得到遗传距离对有效成分的回归方程和有效成分对遗传距离和生境适宜度值的回归方程。结果:1.对龙胆植株性状进行分析。可知丹东市宽甸县植株比较粗高,叶片长宽最大,主根粗大且长,根茎的干重相对于其他产地要高很多。花序数铁岭市西丰县占优势。变异系数结果表明根茎长,茎生中叶长和宽变异系数最小,均低于20%,变异程度小。花序长和宽以及花序数,茎秆数变异系数均大于50%,变异程度大。2.植株性状间相关性分析。结果表明各植株地上部分和地下部分有一定的相关性,株高越高,相应的茎秆数、主茎粗、茎生中叶长、茎生中叶宽、花序数、根茎长、根茎直径、根茎鲜重、根茎干重指标越高。3.植株性状和生态环境因子的相关性分析。通过分析可知地形和土壤是影响龙胆植株性状最重要的环境因素。地上部分如株高,花序长,花序宽,花序数,茎秆数与地形因子坡度和土壤因子含沙量等相关性大。地下部分的大小如根茎长与坡度有一定相关性;根茎直径与日照时数有一定相关性;根茎鲜重与土壤含沙量有一定关系,并且都呈正相关,龙胆植株性状是多种环境因素相互作用的结果。4.对龙胆主要有效成分进行含量测定。桓仁县的龙胆苦苷含量最高,盖州市的龙胆苦苷含量最低。清原县的獐牙菜苦苷含量最高,盖州市的含量最低。庄河市獐牙菜苷含量最大,盖州市最小。新宾县龙胆碱含量最高,盖州市龙胆碱含量最低。盖州市龙胆多糖含量最高,新宾县龙胆多糖含量最低。5.根据Max Ent最大熵模型的计算分析各生态因子在龙胆分布生境适宜度中所占的权重,可以看出11月降水量、11月温度、土壤质地分类（USDA）、8月降水量、最冷月最低温、土壤类型、海拔所占权重贡献率超过90%。生态因子最适宜值范围为海拔在0～1400米分布;最冷月最低温大约在-30℃～-10℃;8月降水200mm～400mm,少于200mm时分布概率明显下降;11月降水在30mm左右,超过或不足30mm时分布概率下降;11月温度-10℃～5℃。土壤最适质地粉沙壤土,壤土;土壤最适类型为黑土,暗色火山灰土,石灰性黑土,铁质淋溶土。6.将潜在分布区划分为不适宜区,次适宜区和最适宜区三个等级。辽宁省的最适宜分布区为本溪市、抚顺市、丹东市;次适宜分布区为铁岭市、盘锦市、营口市、大连市、辽阳市;不适宜区在阜新市、锦州市、朝阳市、葫芦岛市等。经二次检验,试验结果与课题组实际调查的生产现状一致,预测结果准确,有实际意义。7.不同地区龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、多糖和龙胆碱的含量差异较大,与生态因子密切相关。龙胆苦苷含量与坡度、最暖月最高温、11月降水量呈正相关,与10月降水量呈负相关;獐牙菜苦苷含量与昼夜温差月均值、最冷月最低温成负相关,与3月均温和坡度呈正相关;獐牙菜苷含量与降雨量变异系数呈负相关;多糖含量与6月降雨量呈负相关;龙胆碱含量与坡度呈正相关。8.基于RDA分析和分布适宜性分析得辽宁省龙胆5个最优产区:清原满族自治县南部地区;新宾满族自治县南部地区;本溪满族自治县中东部地区;桓仁满族自治县的中西部地区;宽甸满族自治县北部地区。9.基于辽宁省龙胆最优产区图,综合考虑药材的产量和栽培技术,将辽宁省龙胆分为三大产区。一级产区主要包括清原满族自治县、新宾满族自治县、本溪满族自治县、桓仁满族自治县、宽甸满族自治县。二级产区主要包括凤城满族自治县、岫岩满族自治县、铁岭县、抚顺县、本溪县。三级产区主要包括西丰县、辽阳县、盖州市、大连庄河市。10.筛选出的8个ISSR引物共扩增出145个条带,其中多态性条带142条,多态性条带百分率98.01%。供试材料各居群间的遗传相似性系数（GS）和遗传距离（GD）分别介于0.5525～0.9974和0.0027～0.6624。通过遗传相似性系数表明:遗传相似性系数最小为0.5260,来自居群13（铁岭）与4（盖州）,表明这个居群的遗传亲缘关系最远;其遗传相似性系数最高为0.9974,来自居群20（岫岩）与21（岫岩）,表明这两个居群亲缘关系最近。通过遗传距离分析表明:居群5（桓仁）与14（西丰）的遗传距离为最大0.6624,表明这2个居群亲缘关系最远;20（岫岩）和21（岫岩）其遗传距离为最低0.0027,表明这2个居群亲缘关系最近。结果表明龙胆有较高的遗传多样性,遗传多样性与地理位置有一定的关系。辽宁省龙胆Nm=0.00148,说明龙胆基因流动性较低,遗传背景单一。11.遗传因子与龙胆多糖和獐牙菜苷含量不相关,龙胆多糖和獐牙菜苷的形成机理有待进一步研究。生境因子对龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆碱（秦艽甲素）、龙胆多糖含量以及主成分得分均有显著的影响。结论:1.植株性状分析研究不同产区的龙胆间植株性状存在明显的差异,根茎长、茎生中叶长和宽变异程度最小,花序长和宽以及花序数、茎秆数变异程度较大,造成这一现象的原因是遗传因素,环境因子共同作用的结果。2.植株性状间相关性分析植株性状之间也存在相互影响,不同的植株性状具有一定关联性,地上部分和地下部分也具有一定关联性。相关分析可知龙胆株高这一性状有利于有效成分的积累和龙胆的种子生产,同时也可根据地上部分的大小来预测产量,为优良性状的筛选提供参考。3.植株性状与环境因子的相关分析龙胆植株性状是多种环境因素相互作用的结果,通过植株性状和环境因子的相关性分析可知地形和土壤是影响龙胆植株性状最重要的环境因素。4.辽宁龙胆质量分析对23个产地的龙胆进行含量测定,指标性成分龙胆苦苷均达到2020版《中国药典》要求（2%）[2]。测定的龙胆主要成分包括龙胆苦苷,獐牙菜苦苷,獐牙菜苷,龙胆碱,龙胆多糖。桓仁县的龙胆苦苷含量最高,清原县獐牙菜苦苷含量最高,庄河市獐牙菜苷含量最高,新宾县龙胆碱含量最高,盖州市龙胆多糖含量最高。龙胆发挥作用最重要的成分为环烯醚萜苷类,因此综上所述,桓仁县的龙胆质量最好。5.辽宁省龙胆区划研究辽宁省龙胆的区划研究对于基于野生龙胆分布地区的栽培龙胆的开发有指导意义,避免了盲目引种造成的资源浪费,规划最优产区,引导农户合理选址种植。分布区划区域修正可根据植被分类和实际情况来修正,去除明显的错误,虽然使结果的分布区域变得更小,但是结果更加准确,获得更可靠的潜在分布区域。进行中药龙胆在辽宁省的品质区划研究,对辽宁省龙胆产区进行分级,对于指导龙胆的合理种植,开发和引种,提高药材质量有重要意义。6.辽产龙胆ISSR-PCR反应体系的建立及遗传多样性分析本实验基于单因素试验和正交试验相结合优化龙胆的ISSR-PCR反应体系,运用最优的反应体系对23个居群,230个龙胆样品的遗传多样性参数分析表明龙胆有较高的遗传多样性,种群间的变异程度大于中群内的变异程度,遗传背景单一,遗传多样性与地理位置存在一定的关系。评价不同产地间亲缘关系,为龙胆合理开发利用和保护提供依据。7.环境因子与遗传的关联分析对龙胆道地性形成的影响生态因子、遗传因子对龙胆道地性有一定影响。遗传因子与龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、龙胆碱含量有相关性,与龙胆多糖、獐牙菜苷含量不相关。生境因子对龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆碱（秦艽甲素）、龙胆多糖含量均有显著的影响。遗传与环境因子均会影响龙胆质量,尤其是对环烯醚萜苷类成分的作用,因此可通过改变遗传或环境因素提高环烯醚萜苷类的含量。