DNRA过程的环境分布规律及其介导的脱氮体系构建和机理研究

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硝酸盐污染会造成生态环境破坏和健康风险,控制硝酸盐污染势在必行。反硝化是各种环境中去除硝酸盐的最常见的途径,关于反硝化工艺的研究已经比较全面和成熟,对另一种微生物驱动的硝酸盐还原途径——异化硝酸盐还原为铵(Dissimilatory nitrate reduction to ammonium,DNRA)的关注却较少。不同于反硝化,DNRA过程将硝酸盐还原为铵盐保留在环境中。目前关于DNRA的研究大多集中在自然生境中DNRA的活性和对硝酸盐还原的贡献,对于DNRA菌群的环境分布规律及其群落组装的深层机制关注甚少。硝酸盐还原过程由微生物驱动,因此,有必要明确自然生境中DNRA菌群的分布、驱动因素及组装机制。另外,在混合菌群内,DNRA过程的中间产物亚硝酸盐和最终产物铵盐可被其他氮循环过程进一步利用。目前,在实验室条件下对混合菌群中DNRA过程的研究仍处于起步阶段。因此,明晰DNRA过程在混合菌群内与其他氮循环过程的协同作用路径和微生物代谢机制,对于推动DNRA过程的应用和发展是十分重要的。本论文以DNRA过程为研究对象,首先,以水生生态系统中硝酸盐还原过程为切入点,对DNRA菌的环境分布规律和群落组装机制进行了表征;随后,在实验室水平,构建了以厌氧氨氧化菌(Anaerobic ammonium oxidation bacteria,AnAOB)介导的DNRA过程为关键途径的脱氮体系;最后,在不添加有机碳的情况下,对高硫环境硫自养硝酸盐还原体系内微生物氮、硫转化途径和作用机制进行了研究。具体结论如下:(1)以松花江流域为研究区域,对淡水生态系统中DNRA过程、DNRA菌群的环境分布规律和群落组装机制进行了调查研究。结果表明:在松花江流域十二个采样点中,有六个采样点检测到DNRA过程,DNRA潜在速率为0.25±0.23~4.22±0.61 μmolN/L/h,占六个采样点硝酸盐还原总量的33.07%至98.08%,这说明DNRA过程对硝酸盐还原的重要作用不可忽视。对DNRA菌的分子标记物nrfA基因进行q-PCR实验和高通量测序,nrfA基因丰度为5.29×104±2.61×104~6.65×106 ± 1.23×106 copies/g dry weight,优势 DNRA 菌属是 Sorangium,Corallococcus,Luteitalea,Lancunisphaera,Pseudopropionibacterium 和 Actinomyces。通过分子生态网络分析构建了 DNRA种内互作网络,鉴定出39个OTU属于模块核心,3个OTU属于模块间连接节点。DNRA菌地杆菌科Geobacteraceae是DNRA种内网络和整个细菌共现网络的潜在关键科。结合Spearman相关分析表明,nrfA基因丰度、DNRA速率与属于模块核心的OTU 6176丰度显著相关。零模型和中性群落模型表明,确定性过程和随机过程共同驱动松花江沉积物中DNRA微生物群落组装,其中同质选择和生态漂移分别解释了 27.27%和36.36%的DNRA微生物群落组装。(2)以黄渤海海域为研究区域,对海洋生态系统中DNRA过程、DNRA菌群的环境分布规律和群落组装机制进行了调查研究。结果表明:DNRA过程广泛分布在中国北部沿海海洋生态系统中,尤其是渤海海域,平均DNRA潜在速率为8.15±6.30 μmol N/L/h,显著高于反硝化。对DNRA菌的分子标记物nrfA基因进行q-PCR实验和高通量测序,nrfA基因丰度为1.64×103±4.18×102至3.08×105±2.67×104copies/gdryweight。在渤海和北黄海,最主要的 DNRA 属是Pelobacter、Nibricoccus 和 Opitutus,在南黄海,优势 DNRA 属是Lacunisphaera、Bythopirela、Nibricoccus、Opitutus和Anaeromyxobacter。通过分子生态网络分析构建了 DNRA种内网络,鉴定出2个OTU属于网络核心,4个OTU为模块核心,13个OTU为模块间连接节点。Pelobacter和Opitutus是DNRA群落中属水平的模块核心和模块间连接节点。空间因素显著地影响了黄渤海的DNRA群落的变化,不同海域的DNRA群落组成表现出显著差异。Mantel检验表明沉积物中DNRA微生物群落组成与沉积物含水率、总氮、总硫、氨氮浓度和采样点的经度、纬度、深度以及底层水温、电导率显著相关。零模型和归一化随机率分析说明随机过程是黄渤海底泥DNRA微生物群落组装的主要驱动因素,均质扩散(16.30%)和生态漂移(72.10%)是控制黄渤海DNRA群落组装最重要的随机性过程。(3)在实验室水平,构建了以AnAOB介导的DNRA过程为关键途径的脱氮体系,并通过宏基因组测序对反应器中微生物群落演替和代谢路径进行了解析。结果表明:在COD/NO3--N 比为0.6时,反应器NH4+-N和NO3--N平均去除率为60.6 ± 9.7%和 44.4±4.3%;在 COD/NO3--N 比为 1.2 时,NH4+-N 和 NO3--N 去除率最高可达100.0%和68.7%,这说明COD/NO3--N 对AnAOB介导的DNRA过程十分重要。以甲醇抑制AnAOB活性后,异养菌仅贡献约20mg/L的硝酸盐还原量,这说明反应器内还原硝酸盐和氧化乙酸盐的关键菌群是AnAOB。q-PCR实验表明乙酸盐和硝酸盐对AnAOB的丰度没有消极影响,同时促进了反硝化功能基因的增长。宏基因组测序结果显示,Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia和Ignavibacterium是该新型脱氮体系中的优势属,CandidatusBrocadia sinica、Candidatus Kuenenia stuttgartiensis、Candidatus Brocadia sp.AMX2 和Candidatus Brocadiafulgida是反应器中最主要的 AnAOB。在 AnAOB 介导 DNRA过程的脱氮体系中,存在nrfA和nrfH基因的Candidatus Brocadia sinica,是反应器内执行DNRA功能的主要细菌。与乙酰辅酶A途径相关的功能基因丰度增加,说明反应器内细菌通过乙酰辅酶A途径代谢乙酸盐。综上所述,这种新型脱氮体系可能会促进Anammox在主流脱氮工程中的应用。(4)在不添加有机碳的情况下,对高硫环境硫自养硝酸盐还原体系内微生物氮、硫转化途径和作用机制进行了研究。结果表明:实验初期,N/S比为1和0.67时,反应器内产生NH4+-N,NH4+-N最大转化率分别为51.0%和25.1%,这说明硫自养DNRA和反硝化在反应器中共存。在N/S比低于0.5时,反应器内积累了大量的亚硝酸盐,这说明体系内主要是部分反硝化过程。随着培养时间的增加,在N/S比为1和0.67的反应器内,硫自养DNRA产生的NH4+-N和硫氧化产生的SO42--S同步减少,这说明NH4+-N可能通过硫酸盐型厌氧氨氧化过程以硫酸盐为电子受体被氧化为N2。15N同位素孵育实验表明,N/S比=1和N/S 比=0.67时DNRA潜在速率最高,分别达到了 27.5±0.2μmol N/L/h和3.9± 0.02μmol N/L/h,这与长期试验结果一致。高通量测序的结果显示,发酵细菌Candidatus Caldatribacterium和硫酸盐还原菌 Anaerolinea、Syntrophobacte 是 5 个不同N/S比的反应器中的优势菌属。Soehngenia、Vulcanibacillus、Bacillus和Syner-01在N/S比为1和0.67的反应器中丰度较高,它们具有硫氧化、硝酸盐还原和硫酸盐还原的功能。另外,在N/S比为1和0.67的反应器中,DNRA过程的功能基因(nrfH和nrfA)丰度显著增加,这促使硝酸盐进一步形成铵盐。高浓度(>480mg/L)的硫化物抑制了nirK、norB、norC和nosZ等反硝化过程的功能基因,导致体系内明显的亚硝酸盐积累。污泥细菌群落中编码硫氧化途径的基因(sqr、dsrA、dsrB、aprA和aprB)丰度高于编码 Sox 途径的基因(soxA、soxB、soxC、soxX、soxY和soxZ)丰度,这说明硫化物氧化途径是5个反应体系中硫氧化过程的主要路径。
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