目的:针对2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）核心病机“中满内热”,探讨清热通腑代表方大黄黄连泻心汤通过调节自噬干预T2DM模型INS-1细胞的作用及影响,经网络药理学及分子对接分析大黄黄连泻心汤的有效成分及作用靶点,借助非靶向代谢组学进一步验证大黄黄连泻心汤含药血清作用的相关成分和靶点,为明确本方治疗T2DM提供实验依据。方法:1网络药理学及分子对接分析大黄黄连泻心汤与T2DM的关系1)在TCMSP数据库中检索大黄黄连泻心汤成分,以OB≥30%和DL≥0.18为标准筛选,并在TCMID数据库中查找并补充活性成分,汇总构建活性成分数据库,在Swiss Target Prediction与Pharm Mapper数据库中检索活性成分可作用靶点;2)在Genecards、Dis Genet、Uniprot数据库中搜索并构建T2DM靶点数据库;3)绘制大黄黄连泻心汤与T2DM韦恩图,确立共同靶点,导入STRING数据库建立蛋白互作网络,筛选核心靶点,通过Cytoscape建立药物-靶点-疾病网络,进行GO生物过程与KEGG通路富集分析;4)根据网络药理学分析结果选取重要化合物,在Pub Chem数据库中测定化合物的名称、分子量和2D结构,选择目的蛋白并在RCSB PDB数据库中获得蛋白受体的3D结构;5)通过Py MOL提取蛋白质的原始配体结构,通过Auto Dock进行处理和对接,在Py MOL上分析对接结果。2细胞实验验证大黄黄连泻心汤含药血清对T2DM模型INS-1细胞的疗效及机制课题组前期体内实验表明本方有降血糖的作用,对T2DM有效,因此进一步通过体外实验补充证明本方治疗T2DM的相关机制:1)高糖培养并建立胰岛β细胞损伤模型,并将对数生长期细胞分为空白组（K组）、正常大鼠血清组（Z组）、模型组（M组）、空白+抑制剂组（KY组）、模型+抑制剂组（MY组）、黄连单药组（H组）、黄连+抑制剂组（HY组）、大黄黄连泻心汤组（D组）、大黄黄连泻心汤+抑制剂组（DY组）;2)各组干预后通过CCK-8法检测细胞增殖活性,通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组胰岛素分泌水平,通过蛋白免疫印迹技术（Western blot）及免疫荧光技术检测各组自噬相关的蛋白表达,通过实时荧光定量聚合酶链反应技术（RT-PCR）检测各组自噬相关的m RNA表达,通过透射电镜观察细胞损伤及自噬情况。3非靶向代谢组学补充大黄黄连泻心汤含药血清对T2DM模型INS-1细胞作用的成分及通路分析1)将含药血清进行处理后采用SHIMADZU-LC30超高效液相色谱系统（UHPLC）使用HILIC色谱柱进行分离;2)用QE Plus质谱仪（Thermo Scientific）进行质谱分析;2)采用MSDIAL进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积,通过HMDB、Mass Bank等数据库整合正负离子峰后用SIMCA-P进行模式识别;3)数据经Unit variancescaling预处理后进行多维统计分析。结果:1网络药理学及分子对接结果1)数据库中筛出大黄黄连泻心汤相关化合物397个,包括榭皮素、β-谷甾醇、大黄素等,通过药物-疾病交互得到128个重叠靶点,其中包括EGFR、MMP9、TP53、MAPK1、TNF等42个核心靶点;2)GO富集分析得到凋亡、细胞增殖、细胞生长等生物过程,质膜、胞浆、外泌体等细胞组成,类固醇结合、蛋白结合、药物结合等分子功能;3)KEGG通路富集分析得到PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等;4)分子对接结果显示槲皮素与INSR的结合力最强,小檗碱与GLUT4的结合力最强。2细胞实验结果1)CCK-8法检测结果表明45mmol/L糖浓度干预48h时细胞存活率较正常细胞有显著改变（P＜0.05）,10%含药血清干预24h后M组较K组有显著改变（P＜0.01）,D组、H组较M组有显著改变（P＜0.05）;2)ELISA法检测发现45mmol/L糖浓度干预48h后,胰岛素浓度较5.6mmol/L糖浓度时开始下降（P＜0.01）,各组干预后M组较K组胰岛素浓度明显增加（P＜0.01）,D组、H组较M组的胰岛素浓度有所恢复（P＜0.01）;3)Western blot与免疫荧光检测结果提示成模后的Beclin1、LC3B蛋白表达上调,P62蛋白表达下调（P＜0.01）,药物干预后D组较M组Beclin1、LC3B蛋白表达量减少（P＜0.01）,Western blot结果中P62蛋白表达量增加显著（P＜0.01）,免疫荧光检测中P62蛋白表达量增加明显（P＜0.05）;4)RT-PCR检测结果与Western blot检测结果呈正比,且mi RNA-29基因表达量在成模后显著增加（P＜0.01）,给予含药血清后各组基因表达量较M组下调（P＜0.01）;5)透射电镜下M组细胞损伤严重,自噬小体大量分布（P＜0.01）,D组细胞结构有所恢复,自噬小体明显减少（P＜0.01）。各种检测结果中,MY组较M组改变均显著（P＜0.01）,D组干预效果优于H组,HY组与DY组干预效果与M组相比最为明显（P＜0.01）。3非靶向代谢组学分析结果1)大黄黄连泻心汤含药血清与空白血清差异显著,共筛出显著差异的代谢物225种,其中有机酸、生物碱、脂类较多;2)进行KEGG通路富集分析得到相关性较强的铁死亡信号通路、不饱和脂肪酸的生物合成信号通路等排名前10的信号通路。分析结果可与网络药理及分子对接分析结果相互补充。结论:1研究证实具有清热通腑功效的大黄黄连泻心汤具有多分子、多靶点、多途径的调控作用,大黄黄连泻心汤的多种活性成分作用于T2DM相关的信号通路。2高糖诱导INS-1细胞,可使细胞过度自噬,导致胰岛β细胞损伤。3实验证实抑制INS-1细胞过度自噬,调节自噬相关Beclin1、LC3B、P62表达,可能是大黄黄连泻心汤治疗T2DM的关键作用机制之一。