【摘 要】
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目的:Wnt/β-catenin信号通路在T-ALL的发病机制中起重要作用,其异常激活可促进T-ALL的发生和发展。前期研究已经表明白藜芦醇具有抗T-ALL的作用,本研究拟通过细胞水平和动物模型观察白藜芦醇对急性T淋巴细胞白血病作用后Wnt/β-catenin信号通路中信号分子的变化,进一步探讨白藜芦醇体内外抗急性T淋巴细胞白血病的作用机制,为T-ALL的治疗提供新的解决思路。方法:1.以人淋巴细
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目的:Wnt/β-catenin信号通路在T-ALL的发病机制中起重要作用,其异常激活可促进T-ALL的发生和发展。前期研究已经表明白藜芦醇具有抗T-ALL的作用,本研究拟通过细胞水平和动物模型观察白藜芦醇对急性T淋巴细胞白血病作用后Wnt/β-catenin信号通路中信号分子的变化,进一步探讨白藜芦醇体内外抗急性T淋巴细胞白血病的作用机制,为T-ALL的治疗提供新的解决思路。方法:1.以人淋巴细胞白血病Molt-4和Jurkat细胞为研究对象,设空白对照组（Control组）、二甲基亚砜组（DMSO组）、白藜芦醇处理组（Re s组）。Control组不做任何处理;DMSO组每毫升细胞加0.4μL DMSO溶液;Res组设R100（Res终浓度:100μmol/L）和R200（Res终浓度:200μmol/L）两个浓度梯度。采用CCK-8法检测细胞增殖情况,选取适合的给药浓度。分别在处理后的第24小时提取RNA,第48小时提取蛋白质进行后续试验。2.按照随机原则,将15只6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠分成三组。正常对照组（Control组）:0.05%DMSO灌胃处理;T-ALL模型组（T-ALL组）:0.05%DMSO灌胃处理;白藜芦醇处理组（Res组）:100mg/kg/d白藜芦醇灌胃处理。连续灌胃6周后,向T-ALL组和Res组小鼠尾静脉注射ICN1-GFP+T-ALL细胞,建立T-ALL小鼠模型,Control组小鼠则尾静脉注射等体积的RPMI-1640培养基。3.分别在造模第7、14和21天,采用流式细胞术检测三组小鼠外周血中ICN1-GFP+T-ALL细胞的百分比,第14天小鼠外周血ICN1-GFP+T-ALL细胞超过10%时,证明T-ALL小鼠造模成功。4.应用实时荧光定量PCR（RT-PCR）分别检测各组细胞和小鼠脾脏组织中c-Myc和Cyclin D1 mRNA的表达水平。5.应用蛋白免疫印迹法（Western Blot法）分别检测各组细胞和小鼠脾脏组织中β-catenin、TCF-1、LEF-1、c-Myc和Cyclin D1的蛋白表达水平。结果:1.CCK-8结果显示,白藜芦醇作用于人淋巴细胞白血病Molt-4和J urkat细胞后,细胞增殖能力明显降低（P＜0.01）,随着白藜芦醇浓度的增加,对细胞增殖能力的抑制作用逐渐增强（P＜0.01）。因此,选取白藜芦醇终浓度为200μmol/L剂量进行后续实验。2.RT-PCR结果所示,与Control组和DMSO组相比,Res组Molt-4和Jurkat细胞中c-Myc和Cyclin D1 mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）。3.Western blot结果显示,与Control组和DMSO组相比,经白藜芦醇处理后,Molt-4和Jurkat细胞中β-catenin、TCF-1、LEF-1及其靶蛋白c-Myc和Cyclin D1表达水平均显著降低（P＜0.05）。4.小鼠生存状况:与Control组比较,T-ALL组小鼠精神萎靡,小鼠腹部明显膨隆,Res组小鼠精神状态较T-ALL组小鼠有所改善,小鼠腹部轻度膨隆,脾脏较T-ALL组明显减小。5.流式细胞术结果:在造模第14和21天,T-ALL组小鼠外周血中GFP+白血病细胞比例显著升高,经白藜芦醇处理后明显下降（第14和21天P＜0.01）。6.小鼠脾脏组织中c-Myc和Cyclin D1基因表达水平:与Control组小鼠相比,T-ALL组小鼠c-Myc和Cyclin D1 mRNA表达水平显著增高（P＜0.01）,经白藜芦醇处理后,Res组小鼠c-Myc和Cyclin D1 mRNA表达水平明显降低（P＜0.01）。7.小鼠脾脏组织中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达结果:与Control组小鼠相比,T-ALL小鼠脾脏组织中β-catenin、TCF-1、LEF-1及靶蛋白c-Myc和Cyclin D1表达水平显著升高（P＜0.01）,经白藜芦醇处理后,Res组小鼠各蛋白表达水平明显下调（P＜0.01）。结论:在T-ALL细胞株和动物模型中,白藜芦醇可通过下调Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、TCF-1和LEF-1的表达进而抑制靶蛋白c-Myc和Cyclin D1水平,发挥抗急性T淋巴细胞白血病作用。
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