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1 背景和目的颈动脉狭窄是常见的外周血管疾病之一,主要受饮食、遗传、吸烟等因素的影响,多于中老年人发病。颈动脉粥样硬化斑块是导致脑卒中的重要原因,占所有脑卒中原因的80%-85%,具有很高的致死和致残率,给个人、家庭以及整个社会带来沉重的负担。目前,颈动脉内膜剥脱术（CEA）和颈动脉支架植入术（CAS）是临床上治疗颈动脉狭窄的两种主要方法。然而,颈动脉内膜增生或血管内再狭窄仍然是影响颈动脉手术远期效果的主要危险因素。因此,探究颈动脉内膜增生的机制对提高颈动脉狭窄术后远期通畅率具有重要意义。自噬是一种细胞内保守的自我降解并反复利用有用物质的过程,通过溶酶体及溶酶体内的酶降解有害的细胞成分或细胞器,从而维持细胞内环境稳定和正常功能。既往多项研究研究表明,自噬在调节血管平滑肌细胞（VSMCs）生物学功能方面发挥重要作用。在心血管疾病中,肾素-血管紧张素系统主要通过血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）结合其细胞表面受体发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）的心血管作用主要通过AngⅡ1型受体（AT1R）介导。AT1R的羧基端结构域在受体脱敏、内化和信号转导等方面发挥重要作用。血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白（ATRAP）是一种新的受体相互作用蛋白,广泛存在于人体的各种组织中,ATRAP具有三个跨膜结构域,能与AT1R的羧基端结构域特异性结合。研究证实,ATRAP能增加AT1R内化,在AT1R介导的血管平滑肌细胞增殖中起负性调控作用。受体内化能减少细胞表面相应受体数量,减少受体激活,是一种特殊的信号传导减弱机制。越来越多的研究表明,ATRAP在血管平滑肌细胞增殖、迁移中发挥重要作用。然而,在颈动脉内膜增生中,ATRAP的作用机制尚不清楚。本研究利用C57BL/6J背景的野生型小鼠和ATRAP-/-小鼠,建立颈动脉导丝损伤模型,验证ATRAP在颈动脉内膜增生中的表达情况,并探究敲除ATRAP对内膜增生的影响。然后利用小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞（MOVAS）,通过质粒转染siRNA的方式下调MOVAS中ATRAP的表达,检测下调ATRAP对小鼠胸主动脉血管平滑肌细胞表型转化、迁移和增殖的影响。同时,通过体内和体外实验,探究ATRAP影响血管平滑肌细胞生物学功能和颈动脉内膜增生的机制,为研究颈动脉内膜增生的发病机制及治疗提供有力证据。2 材料和方法2.1 检测ATRAP在小鼠损伤颈动脉中的表达情况随机选取12只8-10周龄的野生型雄性C57小鼠,对其左侧颈动脉进行导丝损伤,右侧颈动脉作为对照。损伤后28天取双侧颈动脉组织,利用苏木精-伊红染色法（HE染色）及ImageJ软件测量内膜增生情况,用免疫组化染色及Western blot实验技术检测导丝损伤颈动脉中ATRAP的表达情况。2.2 检测敲除ATRAP对小鼠颈动脉内膜增生的影响随机选取12只8-10周龄的野生型雄性C57小鼠和12只雄性ATRAP-/-小鼠,分别对其左侧颈动脉进行导丝损伤,右侧颈动脉作为对照。损伤后28天取双侧颈动脉组织,利用HE染色及ImageJ软件测量并比较两组小鼠颈动脉内膜增生面积及内膜/中膜比,并利用免疫组化染色技术检测损伤颈动脉中PCNA、a-SMA的表达情况。2.3 检测下调MOVAS中ATRAP的表达量对其生物学功能的影响通过质粒转染siRNA的方法下调MOVAS中ATRAP的表达量,利用RT-qPCR技术检测siRNA的转染效率。通过CCK-8实验方法检测细胞增殖情况,划痕实验方法检测细胞迁移情况,transwell实验方法检测细胞侵袭和迁移。2.4 探究ATRAP对颈动脉内膜增生及MOVAS生物学功能影响的机制2.4.1 ATRAP在颈动脉内膜增生中对自噬的影响利用免疫组化染色方法比较WT小鼠和ATRAP-/-小鼠损伤颈动脉中自噬相关分子的表达情况。2.4.2 下调ATRAP对MOVAS中自噬相关分子表达的影响提取细胞蛋白并利用Western blot实验方法检测下调ATRAP表达对MOVAS中自噬相关分子P62、LC3 Ⅱ表达的影响。2.4.3 下调ATRAP表达对MOVAS中自噬相关信号通路关键分子表达的影响提取细胞蛋白并利用Western blot实验方法检测下调ATRAP表达对MOVAS中自噬相关信号通路关键分子PI3K、mTOR表达的影响。3 结果3.1 损伤颈动脉中ATRAP的表达降低小鼠颈动脉组织HE染色结果显示,导丝损伤28天后内膜增生明显。免疫组化染色结果显示,损伤颈动脉中ATRAP的表达较对照组降低。同时,颈动脉组织提取蛋白后Western blot试验结果也显示,ATRAP的表达较正常颈动脉降低。3.2 敲除ATRAP能促进血管平滑肌细胞表型转化和增殖,并促进颈动脉内膜增生。分别对WT小鼠和ATRAP-/-小鼠的颈动脉进行导丝损伤,术后28天对颈动脉组织进行HE染色、免疫组化染色。ImageJ软件测量结果提示,与WT小鼠相比,ATRAP-/-小鼠的颈动脉内膜增生明显增加。免疫组化染色结果显示,ATRAP-/-小鼠颈动脉增生内膜中PCNA表达升高,a-SMA的表达降低。3.3 下调MOVAS中ATRAP的表达促进细胞表型转化、迁移和增殖。通过质粒转染siRNA的方法下调MOVAS中ATRAP的表达,RT-qPCR实验结果显示ATRAP的敲低效率约为60%。CCK-8实验方法的检测结果提示,下调ATRAP表达能促进细胞增殖。划痕实验方法的检测结果显示,下调ATRAP能促进细胞迁移。Transwell实验结果显示,下调ATRAP表达能促进细胞迁移和侵袭。3.4 ATRAP通过自噬调控MOVAS表型转化、迁移和增殖,并影响内膜增生。3.4.1 ATRAP通过自噬影响颈动脉内膜增生体内实验的免疫组化结果显示,与WT小鼠相比,ATRAP-/-小鼠损伤颈动脉中自噬相关分子P62的表达升高,LC3Ⅱ的表达降低。3.4.2 下调ATRAP表达后MOVAS中自噬被抑制体外实验的Western blot结果显示,下调ATRAP表达后,MOVAS中自噬相关分子LC3 Ⅱ的表达降低,P62的表达升高。3.4.3 下调ATRAP表达后MOVAS中自噬抑制信号通路被激活体外实验Western blot结果显示,下调ATRAP表达后,MOVAS中自噬抑制信号通路关键分子PI3K的表达升高,PI3K的下游通路分子mTOR的表达升高。4结论1 ATRAP和颈动脉内膜增生密切相关。2敲低ATRAP能促进血管平滑肌细胞表型转化、迁移和增殖,并促进颈动脉内膜增生。3 ATRAP通过mTOR信号通路介导的自噬促进颈动脉内膜增生。