背景与目的胆石症是一个全球性的公共卫生问题,也是住院医疗的主要原因之一,其发病率正在以惊人的速度增长。据报道,多种代谢性疾病与胆石症的进展有关,包括胰岛素抵抗、全身性炎症、肥胖或2型糖尿病等。肠道菌群失调与代谢性疾病之间的关系已被证实。然而,关于肠道菌群与胆石症发病机制的相互作用尚未明确。近年来,肠道微生态的改变被认为是胆囊结石形成的新病理生理机制。肠道菌群在胆汁酸肠-肝循环和胆固醇代谢中起着重要作用,是胆固醇结石形成的先决条件。一些研究表明,在临床试验和啮齿类动物模型中,使用某些细菌作为益生菌可以降低胆固醇水平。本研究中,我们应用宏基因组测序技术分析了胆囊结石患者和健康对照组的肠道微生态环境,并且通过粪菌移植技术动物实验体内验证人类胆囊结石患者的肠道微生态与小鼠胆囊结石形成的相互关系。方法1.研究对象:2017年1月至2019年9月期间于我院接受内镜下经胃或经直肠保胆取石治疗的患者18例。同时,招募年龄、性别和体重指数与胆囊结石组患者相匹配的健康对照组18例。2.DNA提取及测序:使用QIAamp迷你试剂盒（Qiagen,Hilden,Germany）从人粪便样本中提取DNA,使用Qubit（?）2.0荧光计（Life Technologies,CA,USA）对DNA进行定量,并使用琼脂糖凝胶电泳估计分子大小,筛选合格的DNA样品构建文库并行文库检测,测序采用IlluminaPE150平台。3.动物模型制备:①选取6周龄健康雄性SPF级C57BL/6N小鼠18只;②连续两周用含有0.2g/L氨苄西林、新霉素和甲硝唑以及0.1g/L万古霉素的混合抗生素灌胃以清除小鼠肠道内大部分肠道微生物,2周后收集每只小鼠粪便样本;③分别用胆囊结石组粪便、健康对照组粪便、PBS灌胃,1周3次,56天后处死小鼠,取胆囊、胆汁、肝脏和肠的组织,然后储存在-80℃的冰箱中以备后续分析。4.统计学分析:采用SPSS软件21.0版本进行统计分析,α＜0.05认为具有统计学意义。胆囊结石组和健康对照组的肠道菌群组成使用Kruskal-Wallis试验进行比较。通过LDA效应量（LEfSe）分析确定胆囊结石组与健康对照组之间最可能存在差异的因素。LDA分界点为2.0分,区分了影响因素。组间采用Wilcoxon秩和检验比较连续变量。Fisher精确检验比较分类变量。结果1.本研究共纳入18名胆囊结石患者和18名健康对照者。两组在空腹血糖、胆固醇和甘油三酯水平等生化指标均无显著差异。2.基于Bray-Curtis距离的多变量分析显示,胆囊结石组与健康对照组细菌属水平存在显著差异;与健康对照组相比,胆囊结石组肠道菌群在属水平上丰富度显著增加,丰度显著降低。胆囊结石组较丰富的细菌群为大肠杆菌（Escherichia coli）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）;健康对照组较丰富的细菌群为挑剔真杆菌（Eubacterium eligens）、真细菌 cag:38（Eubacterium sp.CAG:38）、梭状芽孢杆菌cag:217（Clostridium sp.CAG:7）;胆囊结石组中产生丁酸盐的细菌丰度明显减少。3.随机森林邻近矩阵的多维标度（MDS）图显示胆囊结石组的肠道菌群与健康对照组有很大差异。我们的研究表明,肠道微生物生物标志物可用于预测胆固醇胆结石,受试者工作特征（ROC）曲线下面积（area under curve,AUC）的最佳辨别能力为0.855（95%CI 72.8%-98.2%）。4.主坐标分析（PCoA）测量的功能丰度显示,胆囊结石组与健康对照组个体的肠道微生物功能存在显著差异。5.动物实验:①通过离体胆囊的大体观察和偏振光显微镜检查显示,胆囊结石患者粪便灌胃组小鼠的固体结石形成率和胆固醇结晶形成率均显著高于健康对照灌胃组和PBS组;②胆囊结石粪便移植组小鼠胆囊缩小,体积较健康对照粪便移植组和PBS组小;③通过小鼠肠内容物的16S测序分析,结合Shannon指数和Simpson指数显示,与健康对照粪便移植组相比,胆囊结石粪便移植组的肠道微生物多样性显著增加。这些发现证明了肠道菌群在体内胆石形成中起着关键和直接的作用。结论本研究为因肠道菌群改变促进胆囊结石的形成提供了直接有力的证据:特定的微生物群改变可能是胆囊结石发病机制的重要驱动因素。本研究为进一步探究肠道菌群及其代谢物如何参与人类胆囊结石发病机制和分子机制研究奠定了基础。