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目的:头颈鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinomas,HNSCC）是世界上第六大常见的恶性肿瘤,预后较差,5年生存率仍然低于50%。长链非编码RNA（Long non-codingRNA,lncRNA）充当癌基因或抑癌基因在癌症的发生和发展中具有要作用。本研究旨在通过分析癌症基因图谱（The Cancer Genome Altas,TCGA）数据库中HNSCC的RNA-Seq数据,筛选出差异表达的lncRNAs,并鉴定FOXD2-AS1在HNSCC中的表达及与预后的相关性。通过临床组织样本,细胞及动物实验进一步探讨FOXD2-AS1在HNSCC中的作用和调控机制,为HNSCC的诊断和治疗提供参考。方法:第一部分,通过下载分析TCGA数据库中HNSCC测序和临床信息数据,得到差异表达的lncRNAs,构建HNSCC患者的Cox回归模型。综合文献筛选出模型中FOXD2-AS1作为研究对象,应用TCGA单基因分析FOXD2-AS1在HNSCC中的差异表达及其与预后的相关性。并通过基因富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）,研究FOXD2-AS1参与调控的信号通路。利用实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测经手术切除的36例HNSCC组织以及癌旁正常组织中FOXD2-AS1的表达水平,并分析FOXD2-AS1的表达与患者临床病理特征之间的关系。第二部分,采用qRT-PCR检测FOXD2-AS1在正常口腔上皮角质细胞（HOK）和HNSCC细胞（CAL-27,TSCCA,FADU）中的表达水平。制备sh-FOXD2-AS1慢病毒和FOXD2-AS1过表达质粒转染HNSCC细胞,qRT-PCR检测转染效率。采用CCK-8实验检测沉默和过表达FOXD2-AS1对HNSCC细胞增殖能力的影响。划痕实验、Transwell实验分别检测沉默和过表达FOXD2-AS1对HNSCC细胞迁移和侵袭能力的影响。流式细胞实验检测沉默FOXD2-AS1对HNSCC细胞凋亡的影响。蛋白质免疫印迹（Western blotting,WB）检测沉默FOXD2-AS1对上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白表达的影响。裸鼠皮下成瘤实验检测沉默FOXD2-AS1对体内瘤体生长的影响。第三部分,采用核质分离实验检测FOXD2-AS1在HNSCC细胞中的定位分布。通过RNA pull-down实验检测与FOXD2-AS1相结合的蛋白。WB实验分析RNA pulldown洗脱产物中FUS蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫共沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验验证FUS蛋白与FOXD2-AS1相互结合。利用高通量测序技术检测沉默FOXD2-AS1后下游基因的变化,鉴定FOXD2-AS1可能调控的下游靶分子,并与生信网站预测FUS结合的下游分子取交集,确定FOXD2-AS1和FUS共同调控的下游靶分子FADD。RIP实验验证FUS与FADD的结合能力。qRT-PCR和WB验证FADD在HNSCC细胞系中的表达。利用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）和人类蛋白图谱（The Human Protein Atlas,HPA）数据库分析FADD在HNSCC组织中的表达及与FOXD2-AS1的相关性。补救实验验证FADD是FOXD2-AS1的下游靶分子,并且FOXD2-AS1通过调控FADD介导HNSCC细胞增殖和EMT表型。双荧光素酶报告实验检测FOXD2-AS1与FADD启动子的结合能力。使用放线菌素D处理细胞检测FOXD2-AS1结合FUS对FADD mRNA稳定性的影响。最后通过补救实验验证FOXD2-AS1通过与FUS结合增加FADD mRNA的稳定性从而促进FADD的表达。结果:第一部分,通过TCGA数据库,建立了一个基于7个差异表达lncRNAs的Cox回归模型。通过训练集和测试集确认和验证,构建的lncRNAs Cox模型对HNSCC患者的生存具有较好的预测效能。结合文献确定FOXD2-AS1作为目标基因进行研究。TCGA数据库单基因分析结果发现FOXD2-AS1在HNSCC中表达同样上调,P＜0.001。对TCGA数据库中HNSCC的配对样本进行分析,发现FOXD2-AS1在配对肿瘤样品中同样上调表达,P＜0.001。Kaplan-Meier生存分析发现FOXD2-AS1高表达的患者总生存期（overall survival,OS）明显低于FOXD2-AS1低表达的患者,P＜0.01。多因素Cox回归分析显示,FOXD2-AS1的表达水平是HNSCC患者总生存期的独立风险因素（HR=1.002,95%CI=1.001-1.004,P＜0.001）。GSEA富集分析发现FOXD2-AS1主要在“cell cycle”,“DNA replication”,“the p53 signaling pathway”等信号通路中显著富集。qRT-PCR实验结果显示FOXD2-AS1在收集的36例HNSCC组织中表达显著上调,P＜0.05。FOXD2-AS1的表达与肿瘤的T分期（P＜0.05）和TNM临床分期（P＜0.05）呈正相关。第二部分,qRT-PCR实验发现FOXD2-AS1在HNSCC细胞系中表达显著上调（P＜0.001）,且FOXD2-AS1在CAL-27和FADU中表达更高,选择这两个细胞系进行后续实验。沉默FOXD2-AS1慢病毒转染CAL-27和FADU细胞后,细胞中FOXD2-AS1的表达显著降低,其中1号病毒降低最显著（P＜0.001）,CAL-27和FADU细胞转染FOXD2-AS1过表达质粒后FOXD2-AS1的表达显著升高（P＜0.001）。CCK-8实验显示沉默FOXD2-AS1抑制了CAL-27和FADU细胞的增殖（P＜0.05）,过表达则促进了CAL-27和FADU细胞的增殖（P＜0.05）。划痕实验、Transwell实验表明沉默FOXD2-AS1抑制了CAL-27和FADU细胞的侵袭和迁移（P＜0.05）,过表达则促进了CAL-27和FADU细胞的侵袭和迁移（P＜0.05）。但沉默FOXD2-AS1对细胞的凋亡不产生影响（P＞0.05）。此外,沉默FOXD2-AS1后,CAL-27和FADU细胞中EMT相关蛋白N-cadherin表达降低,E-cadherin表达升高（P＜0.01）。动物实验显示,沉默FOXD2-AS1后裸鼠皮下成瘤的体积和重量明显小于对照组（P＜0.05）。第三部分,核质分离实验发现FOXD2-AS1在细胞质和细胞核上均有分布,表明FOXD2-AS1可以通过多种机制发挥作用,包括和RNA结合蛋白质（RNA‐binding proteins,RBP）相结合作用。RNA pull-down实验确定了145个蛋白质可能与FOXD2-AS1相结合,与生物信息学网站预测的FOXD2-AS1可能结合的蛋白取交集,发现FUS蛋白与FOXD2-AS1之间存在结合关系。WB和RIP实验表明FUS可以与FOXD2-AS1相结合（P＜0.001）。在CAL-27和FADU细胞中沉默FOXD2-AS1后测序发现共有47个基因发生变化,表明这些基因可能受FOXD2-AS1的调控,并与生信网站预测FUS结合的下游靶基因取交集,确定FOXD2-AS1与FUS结合共同调控的下游靶基因FADD。通过RIP实验进一步证明了FUS可以与FADD相结合（P＜0.001）。qRT-PCR和WB实验表明FADD在HNSCC细胞系中表达显著上调（P＜0.05）。GEPIA数据库分析结果显示FADD在HNSCC组织中高表达（P＜0.05）,并与不良预后显著相关（P＜0.001）,且FADD的表达与FOXD2-AS1呈正相关（P＜0.001）。HPA数据库中免疫组化数据显示FADD在HNSCC中高表达。将FADD过表达质粒（或空白质粒）与sh-FOXD2-AS1共转染CAL-27细胞和FADU细胞,进一步验证FADD是否作为FOXD2-AS1的下游靶分子,qRT-PCR检测结果表明沉默FOXD2-AS1后FADD的表达下降,而转染FADD过表达质粒可以显著逆转沉默FOXD2-AS1对FADD表达的抑制作用。采用CCK-8实验检测单独沉默FOXD2-AS1及沉默FOXD2-AS1后共转染FADD,HNSCC细胞的增殖能力,结果发现共转染FADD逆转了单独沉默FOXD2-AS1引起的FADD表达水平的降低,促进了HNSCC细胞的增殖（P＜0.01）。WB实验检测EMT相关蛋白的表达,结果显示共转染FADD逆转了单独沉默FOXD2-AS1引起的EMT抑制（P＜0.05）,促进了HNSCC细胞的EMT表型。表明FOXD2-AS1可以通过调控FADD介导HNSCC细胞的增殖和EMT表型。双荧光素酶报告实验发现沉默FOXD2-AS1不影响FADD启动子的转录活性（P＞0.05）,表明FOXD2-AS1可能通过转录后水平影响FADD的表达。放线菌素D处理细胞发现单独沉默FOXD2-AS1后细胞中FADD的降解速率显著增加,而共转染了FUS则逆转了这一过程（P＜0.01）,表明FOXD2-AS1可以通过与FUS结合增加FADD mRNA的稳定性,减缓了FADD的降解速率,促进了FADD的表达。通过qRT-PCR和WB实验检测单独沉默FOXD2-AS1,以及沉默FOXD2-AS1共转染FUS过表达质粒后FADD的表达变化,相比于单独沉默FOXD2-AS1,沉默FOXD2-AS1与FUS质粒共转染后FADD的mRNA和蛋白水平均有显著升高,进一步表明FOXD2-AS1通过与FUS结合增加了FADD mRNA的稳定性促进了FADD的表达。结论:1.通过分析TCGA数据库,建立了基于差异表达lncRNAs的HNSCC Cox风险模型,鉴定了模型中FOXD2-AS1在HNSCC中表达上调,并与HNSCC的进展和预后相关,qRT-PCR实验验证了FOXD2-AS1在HNSCC组织中显著高表达,并与肿瘤的T分期和TNM临床分期显著相关。2.FOXD2-AS1在HNSCC细胞系中高表达,过表达FOXD2-AS1促进了HNSCC细胞的增殖、侵袭和迁移,沉默FOXD2-AS1抑制了HNSCC细胞的增殖、侵袭和迁移,并抑制裸鼠皮下成瘤的生长,但不促进细胞凋亡;沉默FOXD2-AS1影响了EMT相关蛋白的表达,其中E-cadherin表达升高,N-cadherin表达降低。3.FOXD2-AS1可以与FUS蛋白相结合,调控FADD介导HNSCC细胞的表型。机制上,FOXD2-AS1通过与FUS蛋白相结合增加FADD mRNA的稳定性,促进了FADD的表达,进而介导了HNSCC细胞的增殖和EMT表型。