(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯是一种重要的手性有机物,其作为药物中间体具有重要价值。目前生物法生产被广泛研究,生物拆分法由于理论产率限制,最高只能达到50%,因此利用选择性酶合成成为主流,以提高其选择性从而提高产率。本文旨在引入透明颤菌血红蛋白基因（vgb）,观察透明颤菌血红蛋白（VHb）对合成产物的影响,并通过此蛋白构建一个单水相反应体系,以此降低成本,提高生产效率。主要内容研究如下:（1）4-氯-3-羟基丁酸乙酯（（R）-CHBE）工程菌株的构建。本实验构建中间了重组质粒p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH和最终重组质粒p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH-VHb,旨在将两个质粒进行对比,以突出VHb蛋白对酶活及酶转化体系的实际影响。其中最终重组质粒在p ETDuet-1这个双启动子质粒载体上,利用操纵子效应表达三基因,将vgb优化表达体系运用于生产（R）-CHBE的重组质粒构建中。相比三基因双质粒表达体系,本重组质粒减小了菌体细胞环境压力和表达水平压力,并在检测中发现其表达水平较高,低温诱导可减少包涵体的形成。在SDS-PAGE实验中,明显检测到重组蛋白正确折叠,VHb提高了重组蛋白分子正确折叠概率,降低了构建重组菌株成本。通过对酶活测定表明其酶活效率较高,因此选用重组菌BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH和BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH-VHb作为本实验出发菌株。（2）确定（R）-CHBE检测方法。在20 h菌体密度较高,因此收菌较为合理,同时确定了气相色谱法（GC）测定发酵液中4-乙酰乙酸乙酯（COBE）和（R）-CHBE具体含量的方法,由于高浓度时色谱峰较宽,导致低浓度定位溶液与对照品溶液在色谱图中保留时间略有差异。根据以上检测条件优化可以得到:色谱柱:RBX-5（30m*0.32mm*1.00μm）;柱温:初始温度为140℃,以每分钟5℃的速率升温至240℃;进样口温度:180℃;检测器温度:200℃;载气:N2;分流比:50:1;进样量:1μL。此外,其稳定性检测证明底物稳定性较差,若底物剩余含量较少,则可以通过放置的方式使其自然分解,而产物在乙酸乙酯中保存时间较久但随时间会有微量减小,应在反应结束后24 h内尽快检测,以确定发酵液中的产物产量。（3）培养条件和诱导条件优化及VHb对菌体生长的影响。利用重组菌BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH和BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH-VHb作为研究对象,对初始培养基成分进行优化并添加两种无机盐成分以提高菌体的生长能力,最终确定为:胰蛋白胨25 g·L-1,酵母浸出粉15 g·L-1,氯化钠12.5 g·L-1,甘油12.5 g·L-1,磷酸二氢钾1.5 g·L-1,三水合磷酸氢二钾3.01 g·L-1,七水合硫酸镁0.25 g·L-1,硫酸亚铁0.25 g·L-1,硫酸铵0.15 g·L-1,p H 7.0。并且对诱导条件进行了优化以达到酶活的最大提升,确定的最终诱导条件为:改良发酵培养基中接种量为0.5%,在OD600达到0.8时,添加0.5 mmol·m L-1 IPTG,于16℃诱导20 h,最优宿主菌为BL21。经过本实验优化,确定重组菌BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH-VHb为最优菌株,在酶转化体系中转化6 h,最终优化产量为0.511 mmol·m L-1,转化率达到85.1%,后续实验继续优化反应体系以提高产率至90%以上。（4）单水相酶转化体系的构建及VHb对酶转化体系的影响。通过对重组菌BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH和BL21/p ETDuet-1-Bg ADH3-GDH-VHb的继续研究,对其细胞结构通过物理和化学的方式进行处理,以提高其通透性,最终确定了反复冻融法处理效果最佳。通过对酶转化体系成分优化,最终确定了酶转化体系配方,即COBE6 mmol,葡萄糖2.37 g,NADH 10 mg,NADPH 5 mg,七水合硫酸镁0.1 g·L-1,维生素C 4 mmol·L-1。并通过最后的p H和温度优化,得到最终结果p H值范围于6.4～6.6之间,利用1 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节p H,并确定转化温度为30℃。摇瓶阶段添加底物COBE为6 mmol时,得到最终产率为90.5%。这也确定了单水相反应体系中,添加透明颤菌血红蛋白能够增加最终产量,此蛋白对于产酶阶段和反应阶段都有一定帮助。但以扩大产量为目的,增大底物浓度时会损失部分产率。