【摘 要】
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A型流感病毒是正粘病毒科流感病毒属的单股负链RNA病毒。A型流感病毒由于频繁的基因突变和基因重组对公众健康造成严重威胁。环状RNA(circRNA)和mRNA在调节病毒感染宿主过程中具有关键作用,然而环状RNA和mRNA在A型流感病毒感染过程中的表达及作用机制尚未完全清楚。为了更好地理解A型流感病毒感染与circRNA及mRNA表达之间的关系,本研究通过二代测序(NGS)技术鉴定了低致病性H7N9
【基金项目】
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国家重点研发计划(2016YFD0500206); 国家自然科学基金(31772775);
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A型流感病毒是正粘病毒科流感病毒属的单股负链RNA病毒。A型流感病毒由于频繁的基因突变和基因重组对公众健康造成严重威胁。环状RNA(circRNA)和mRNA在调节病毒感染宿主过程中具有关键作用,然而环状RNA和mRNA在A型流感病毒感染过程中的表达及作用机制尚未完全清楚。为了更好地理解A型流感病毒感染与circRNA及mRNA表达之间的关系,本研究通过二代测序(NGS)技术鉴定了低致病性H7N9亚型流感病毒感染小鼠肺脏circRNA与mRNA的表达,通过基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析差异表达的circRNA与mRNA,为进一步研究流感病毒感染的分子机制提供了基础。1 H7N9亚型流感病毒感染小鼠肺脏circRNA与mRNA表达分析本研究通过高通量测序在H7N9亚型流感病毒感染小鼠肺脏过程中鉴定了 7126个circRNAs。通过对鉴定的circRNAs的特征进行分析发现大多数circRNAs是有义重叠的 circRNA(90.43%),而一小部分 circRNAs 是基因间 circRNA(1.84%)和内含子circRNA(0.73%);进一步分析发现circRNAs在所有染色体上均有分布且在2号染色体上分布最多;同时发现circRNAs序列的GC含量主要分布在35%-60%之间。通过circRNAs的差异分析发现在H7N9亚型流感病毒感染过程中共有73个circRNAs差异表达,其中有39个circRNAs表达上调,34个circRNAs表达下调。利用荧光定量 PCR 实验对 circRNAs mmucirc0009606,mmucirc0001350,mmucirc0001306和mmucirc0001379的表达水平进行验证,验证结果表明circRNAs表达水平与测序结果一致。通过Sanger测序技术对circRNAs的环化位点区域的序列进行分析,结果发现circRNAs的环化位点区域的序列没有发生突变和缺失。对差异表达circRNAs进行GO富集分析发现circRNAs参与细胞对干扰素β的反应,先天性免疫反应以及Ⅰ类MHC的抗原呈递等生物学过程。通过KEGG数据库进行通路分析发现circRNAs参与自然杀伤细胞介导的细胞毒性和MAPK信号通路等信号通路。本研究同时发现在H7N9亚型流感病毒感染小鼠过程中mRNA的表达水平发生改变。通过GO富集分析发现差异表达的mRNA参与Toll-like受体,IL-18受体活性和T细胞调节等生物学过程。通过KEGG分析发现差异表达的mRNA参与抗原提呈,TNF信号通路等信号通路。2与A型流感病毒复制生命周期有关的miRNA的初步筛选通过H7N9亚型流感病毒感染小鼠肺脏miRNA芯片测序发现病毒感染后导致宿主miRNA表达丰度发生变化,从测序结果中挑选20个差异表达的miRNA进行研究,分别转染miRNA到A549细胞,转染后24小时以MOI=0.1的剂量感染病毒,感染后48小时收取细胞感染上清进行滴度测定,滴度测定结果表明20个差异表达miRNA均不能调控流感病毒的复制。本研究基于文献报道进一步筛选调控病毒复制过程中IFN反应的miRNA,分别转染miRNA至A549细胞,转染后24小时以MOI=0.1的剂量感染病毒,感染后24小时收取细胞样品,通过荧光定量PCR检测IFN表达水平,结果发现miR-223能够促进流感病毒感染过程中IFN的表达。
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