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目前肝癌人数在国内的规模较大，每年因患肝癌而死亡的人数大约占据世界肝癌死亡总人数的50%。肝癌一般来源于肝炎病变，乙型肝炎病毒诱导肝细胞内多条信号通路和激酶调控，促使肝细胞生长出现畸形变化，进而诱发肝癌。肝细胞癌又是原发性肝癌中最常见的类型，涉及多基因多因素的复杂网络调控。肝癌具有高复发、易转移和预后差的显著特点，因此，阐明肝癌发生发展过程中的分子机制，寻找有效的生物治疗靶标就显得极其重要。
在肝癌的发生发展过程中，涉及基因表达不同水平调控，常见的是转录调控和翻译调控。其中，翻译后修饰是蛋白水平调控的普遍方式，包括磷酸化、泛素化和乙酰化等多种调控形式。本研究主要从泛素化和乙酰化方式入手，研究其在肝癌发生发展中的具体功能及调控机制，总共分为两部分：
第一部分：USP27调节Cyclin E的稳定促进肝癌细胞生长和肝癌发生
肿瘤是一种多基因的系统性疾病，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活，最终表现为细胞周期的起始、运转和终止出现异常，细胞表现出增殖加快、凋亡减少的生长特性。目前已有大量研究指出，Cyclin E的持续高表达诱发细胞周期异常，调控多种癌症的发生发展。在肝癌中，CyclinE的异常高表达与患者的不良预后显著相关。现在已有很多关于CyclinE蛋白修饰和表达调控的研究，但有关CyclinE蛋白去泛素化修饰的研究还未见报道，其在肝癌发生过程中的分子机制也有待研究。因此，本研究主要从去泛素化酶入手，研究调控Cyclin E蛋白泛素化和稳定性，以及去泛素化酶介导Cyclin E调控肝癌的具体功能机制。主要研究内容和结果如下：
①USP27负调控Cyclin E蛋白泛素化促进其蛋白稳定性
DUB文库筛选确定USP27是CyclinE蛋白的去泛素化酶，二者具有特异性相互作用，并且在细胞内存在共定位。过表达USP27抑制Cyclin E蛋白泛素化和降解，延长其半寿期。敲减USP27促进Cyclin E蛋白泛素化和降解，缩短其半寿期。USP27去泛素化酶活性位点缺失后，Cyclin E蛋白的泛素化无明显变化。在敲减USP27的肝癌细胞Hep3B中，Cyclin E蛋白表达明显下调，但加入MG132处理后，Cyclin E的表达又出现显著升高。
②USP27介导Cyclin E促进肝癌发生发展
在肝癌细胞Hep3B中，敲减USP27使细胞周期G1/S阻滞，抑制细胞增殖和克隆形成。再过表达CyclinE后，细胞周期阻滞解除，细胞增殖和克隆形成能力得到回复。过表达USP27促进细胞增殖和克隆形成。敲除USP27抑制裸鼠皮下成瘤。
③5-FU负调控USP27表达抑制肝癌细胞增殖
5-FU处理肝癌细胞后，USP27和Cyclin E的表达下调，并伴随处理时间的延长或浓度的升高而降低，且其通过泛素-蛋白酶体途径进行。在敲除USP27细胞中，加入5-FU，细胞增殖明显被抑制，细胞凋亡增加。
本研究结果证明USP27通过CyclinE促进肝癌细胞的生长、迁移和肿瘤生长，因此这为以USP27/Cyclin E作为肝癌潜在治疗靶标提供理论依据。
第二部分：SIRT7调控USP39乙酰化促进肝癌细胞生长和肝癌发生
乙酰化修饰是蛋白翻译后表达调控的一种重要方式，目前发现有两千种以上的蛋白发生该修饰，其广泛存在于细胞内，参与细胞凋亡、DNA转录和修复、染色质重组和蛋白稳定性等过程。USP39作为一种去泛素化酶，发现于剪接体的形成过程中，负责招募核糖核蛋白U4/U6U5形成三核糖核蛋白，进而促进剪接体结构的稳定。已有报道，预测USP39具有多个磷酸化、乙酰化、泛素化的修饰位点，但相关的研究极少。在肝癌中USP39的高表达与患者的不良预后密切相关。因此，为了探究USP39在肝癌发生发展中的功能和分子机制，我们从乙酰化入手，分析其蛋白修饰的表达调控。主要研究结果如下：
①SIRT7负调控USP39蛋白乙酰化
质谱技术结合免疫共沉淀确定USP39和SIRT7存在特异性相互作用。USP39表达的高低不影响SIRT7蛋白的泛素化水平，而敲减SIRT7可显著促进USP39蛋白乙酰化。过表达SIRT7显著抑制USP39蛋白乙酰化，而SIRT7蛋白酶活性位点缺失后失去对USP39乙酰化的调控。
②SIRT7介导USP39蛋白稳定性
在肝癌细胞Hep3B中敲减SIRT7促进USP39蛋白泛素化，降低细胞核内USP39蛋白表达。敲减SIRT7细胞加入MG132处理后，USP39蛋白表达出现升高。敲减VHL显著促进USP39蛋白表达上升。K508是USP39蛋白的主要乙酰化位点，过表达SIRT7对USP39K508R突变体乙酰化影响不显著。VHL过表达能促进USP39WT泛素化，但对USP39K508R泛素化影响不大。
③SIRT7去乙酰化USP39影响肝癌细胞生长和肿瘤形成
在肝癌细胞Hep3B和MHCC97H中，敲减USP39显著抑制细胞增殖和克隆形成，而回复USP39WT或KR表达后，细胞增殖和克隆形成也出现显著加快。但进一步再过表达SIRT7后，USP39WT细胞增殖和克隆形成又继续加快，USP39KR过表达细胞没有明显影响。敲除SIRT7显著抑制裸鼠皮下成瘤，再过表达USP39WT或KR突变体后，肿瘤生长又出现回复。
本研究结果表明，SIRT7介导USP39的乙酰化水平调节USP39蛋白稳定性参与调控肝癌细胞生长、增殖和肿瘤形成的作用，选择性地抑制SIRT7/USP39将为临床治疗肝癌提供新的分子靶标及可能方法。
在肝癌的发生发展过程中，涉及基因表达不同水平调控，常见的是转录调控和翻译调控。其中，翻译后修饰是蛋白水平调控的普遍方式，包括磷酸化、泛素化和乙酰化等多种调控形式。本研究主要从泛素化和乙酰化方式入手，研究其在肝癌发生发展中的具体功能及调控机制，总共分为两部分：
第一部分：USP27调节Cyclin E的稳定促进肝癌细胞生长和肝癌发生
肿瘤是一种多基因的系统性疾病，涉及原癌基因的激活和抑癌基因的失活，最终表现为细胞周期的起始、运转和终止出现异常，细胞表现出增殖加快、凋亡减少的生长特性。目前已有大量研究指出，Cyclin E的持续高表达诱发细胞周期异常，调控多种癌症的发生发展。在肝癌中，CyclinE的异常高表达与患者的不良预后显著相关。现在已有很多关于CyclinE蛋白修饰和表达调控的研究，但有关CyclinE蛋白去泛素化修饰的研究还未见报道，其在肝癌发生过程中的分子机制也有待研究。因此，本研究主要从去泛素化酶入手，研究调控Cyclin E蛋白泛素化和稳定性，以及去泛素化酶介导Cyclin E调控肝癌的具体功能机制。主要研究内容和结果如下：
①USP27负调控Cyclin E蛋白泛素化促进其蛋白稳定性
DUB文库筛选确定USP27是CyclinE蛋白的去泛素化酶，二者具有特异性相互作用，并且在细胞内存在共定位。过表达USP27抑制Cyclin E蛋白泛素化和降解，延长其半寿期。敲减USP27促进Cyclin E蛋白泛素化和降解，缩短其半寿期。USP27去泛素化酶活性位点缺失后，Cyclin E蛋白的泛素化无明显变化。在敲减USP27的肝癌细胞Hep3B中，Cyclin E蛋白表达明显下调，但加入MG132处理后，Cyclin E的表达又出现显著升高。
②USP27介导Cyclin E促进肝癌发生发展
在肝癌细胞Hep3B中，敲减USP27使细胞周期G1/S阻滞，抑制细胞增殖和克隆形成。再过表达CyclinE后，细胞周期阻滞解除，细胞增殖和克隆形成能力得到回复。过表达USP27促进细胞增殖和克隆形成。敲除USP27抑制裸鼠皮下成瘤。
③5-FU负调控USP27表达抑制肝癌细胞增殖
5-FU处理肝癌细胞后，USP27和Cyclin E的表达下调，并伴随处理时间的延长或浓度的升高而降低，且其通过泛素-蛋白酶体途径进行。在敲除USP27细胞中，加入5-FU，细胞增殖明显被抑制，细胞凋亡增加。
本研究结果证明USP27通过CyclinE促进肝癌细胞的生长、迁移和肿瘤生长，因此这为以USP27/Cyclin E作为肝癌潜在治疗靶标提供理论依据。
第二部分：SIRT7调控USP39乙酰化促进肝癌细胞生长和肝癌发生
乙酰化修饰是蛋白翻译后表达调控的一种重要方式，目前发现有两千种以上的蛋白发生该修饰，其广泛存在于细胞内，参与细胞凋亡、DNA转录和修复、染色质重组和蛋白稳定性等过程。USP39作为一种去泛素化酶，发现于剪接体的形成过程中，负责招募核糖核蛋白U4/U6U5形成三核糖核蛋白，进而促进剪接体结构的稳定。已有报道，预测USP39具有多个磷酸化、乙酰化、泛素化的修饰位点，但相关的研究极少。在肝癌中USP39的高表达与患者的不良预后密切相关。因此，为了探究USP39在肝癌发生发展中的功能和分子机制，我们从乙酰化入手，分析其蛋白修饰的表达调控。主要研究结果如下：
①SIRT7负调控USP39蛋白乙酰化
质谱技术结合免疫共沉淀确定USP39和SIRT7存在特异性相互作用。USP39表达的高低不影响SIRT7蛋白的泛素化水平，而敲减SIRT7可显著促进USP39蛋白乙酰化。过表达SIRT7显著抑制USP39蛋白乙酰化，而SIRT7蛋白酶活性位点缺失后失去对USP39乙酰化的调控。
②SIRT7介导USP39蛋白稳定性
在肝癌细胞Hep3B中敲减SIRT7促进USP39蛋白泛素化，降低细胞核内USP39蛋白表达。敲减SIRT7细胞加入MG132处理后，USP39蛋白表达出现升高。敲减VHL显著促进USP39蛋白表达上升。K508是USP39蛋白的主要乙酰化位点，过表达SIRT7对USP39K508R突变体乙酰化影响不显著。VHL过表达能促进USP39WT泛素化，但对USP39K508R泛素化影响不大。
③SIRT7去乙酰化USP39影响肝癌细胞生长和肿瘤形成
在肝癌细胞Hep3B和MHCC97H中，敲减USP39显著抑制细胞增殖和克隆形成，而回复USP39WT或KR表达后，细胞增殖和克隆形成也出现显著加快。但进一步再过表达SIRT7后，USP39WT细胞增殖和克隆形成又继续加快，USP39KR过表达细胞没有明显影响。敲除SIRT7显著抑制裸鼠皮下成瘤，再过表达USP39WT或KR突变体后，肿瘤生长又出现回复。
本研究结果表明，SIRT7介导USP39的乙酰化水平调节USP39蛋白稳定性参与调控肝癌细胞生长、增殖和肿瘤形成的作用，选择性地抑制SIRT7/USP39将为临床治疗肝癌提供新的分子靶标及可能方法。