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背景
急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由严重感染、创伤和休克等各种肺内外原因引起的，以难治性低氧血症为显著特征的综合征。2012年柏林定义重度ARDS的病死率高达40%。机械通气作为ARDS患者生命支持的重要方法，却可能会加重肺部原有损伤而导致肺部纤维化的发生。研究显示，56%ARDS病人机械通气12天出现纤维化，ARDS合并纤维化的病死率高达57%，机械通气可通过上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)导致肺部纤维增殖的发生，然而发生机制目前尚未完全明确。巨噬细胞分化为静止期M0型巨噬细胞、炎症期M1型巨噬细胞和修复期M2型巨噬细胞。在ARDS的发生发展中，巨噬细胞作用依赖于它们的表型。与健康人相比，ARDS病人肺泡灌洗液巨噬细胞数量增加，去除巨噬细胞，肺纤维化程度减轻，说明巨噬细胞在肺纤维化起着重要作用。极化的巨噬细胞参与肿瘤细胞EMT的进程，而在ARDS肺上皮细胞EMT作用尚不明确，研究巨噬细胞在人肺上皮细胞的EMT中作用显得尤为重要，可进一步加深ARDS相关性肺纤维化机制的认识。
目的
研究机械牵张人肺上皮细胞微环境对巨噬细胞极化的影响以及探讨极化的巨噬细胞在人肺上皮细胞EMT的作用，为ARDS相关性肺纤维化发病机理提供理论支持以及新的治疗方向。
方法
1、肺上皮细胞接受12h/24h/48h机械牵张或静止培养，收集相应时间点的条件培养基。Luminexmultiplex实验检测培养基中促M1(IFN-γ，GM-CSF,TNF-α)及促M2(IL-4, IL-6, IL-10)极化的因子水平。
2、PMA诱导THP-1成M0巨噬细胞，流式检测M0巨噬细胞的标记物CD68和CD11b；牵张/静止条件培养基分别刺激THP-1来源的巨噬细胞(M0)，流式细胞仪检测每组M1(CD197)及M2(CD206)表面标记物表达。
3、建立人THP-1来源的巨噬细胞(M0)和人肺上皮细胞(BEAS-2B)共培养体系，用48h牵张/静止条件培养基分别刺激该共培养体系，特定分组加入血小板生长因子受体抑制剂(Platelet-derived growth factor receptor inhibitor, PDGFRi)，分为无条件培养基对照组、牵张条件培养基组、静止条件培养基组、牵张条件培养基+PDGFRi组、静止条件培养基+PDGFRi组。48h后收集各组细胞培养上清和蛋白，蛋白质印迹法检测EMT标记蛋白表达，酶联免疫吸附法检测各组上清中PDGF水平。
结果
1、24h牵张诱导肺上皮细胞产生促M1极化的细胞因子(IFN-γ,TNF-αandGM-CSF)增加(与静止组相比，P＜0.05)。48h牵张/静止组间促M1极化的细胞因子表达水平无显著差异。24h牵张组促M2极化细胞因子IL-4及IL-6的表达明显增加，48h牵张组的IL-6水平明显高于静止组(与静止组相比，P＜0.05)。
2、肺上皮细胞牵张24h或者48h条件培养基均能诱导M0巨噬细胞高表达M1表面标记物CD197，但仅牵张48h条件培养基组能显著增加M2标志物CD206的表达。
3、单纯牵张组条件培养基或者静止组条件培养基刺激BEAS-2B细胞，无EMT发生。在M0巨噬细胞和BEAS-2B细胞共培养体系中，牵张条件培养基组上皮标记蛋白E-cadherin、CK-8表达下降，而间质标记蛋白α-SMA、N-cadherin表达增高，这提示共培养体系中BEAS-2B细胞发生EMT；牵张条件培养基组上清中PDGF表达水平明显增高(vs静止条件培养基组，P＜0.05)；在牵张条件培养基组加入PDGFRi逆转EMT。
结论
机械牵张诱导肺上皮细胞旁分泌促M1/M2极化因子，促使巨噬细胞向M1和M2极化。极化的巨噬细胞通过释放PDGF促进人肺上皮细胞间质转分化。阻断PDGF能减轻VILI相关性肺纤维化。
急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由严重感染、创伤和休克等各种肺内外原因引起的，以难治性低氧血症为显著特征的综合征。2012年柏林定义重度ARDS的病死率高达40%。机械通气作为ARDS患者生命支持的重要方法，却可能会加重肺部原有损伤而导致肺部纤维化的发生。研究显示，56%ARDS病人机械通气12天出现纤维化，ARDS合并纤维化的病死率高达57%，机械通气可通过上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)导致肺部纤维增殖的发生，然而发生机制目前尚未完全明确。巨噬细胞分化为静止期M0型巨噬细胞、炎症期M1型巨噬细胞和修复期M2型巨噬细胞。在ARDS的发生发展中，巨噬细胞作用依赖于它们的表型。与健康人相比，ARDS病人肺泡灌洗液巨噬细胞数量增加，去除巨噬细胞，肺纤维化程度减轻，说明巨噬细胞在肺纤维化起着重要作用。极化的巨噬细胞参与肿瘤细胞EMT的进程，而在ARDS肺上皮细胞EMT作用尚不明确，研究巨噬细胞在人肺上皮细胞的EMT中作用显得尤为重要，可进一步加深ARDS相关性肺纤维化机制的认识。
目的
研究机械牵张人肺上皮细胞微环境对巨噬细胞极化的影响以及探讨极化的巨噬细胞在人肺上皮细胞EMT的作用，为ARDS相关性肺纤维化发病机理提供理论支持以及新的治疗方向。
方法
1、肺上皮细胞接受12h/24h/48h机械牵张或静止培养，收集相应时间点的条件培养基。Luminexmultiplex实验检测培养基中促M1(IFN-γ，GM-CSF,TNF-α)及促M2(IL-4, IL-6, IL-10)极化的因子水平。
2、PMA诱导THP-1成M0巨噬细胞，流式检测M0巨噬细胞的标记物CD68和CD11b；牵张/静止条件培养基分别刺激THP-1来源的巨噬细胞(M0)，流式细胞仪检测每组M1(CD197)及M2(CD206)表面标记物表达。
3、建立人THP-1来源的巨噬细胞(M0)和人肺上皮细胞(BEAS-2B)共培养体系，用48h牵张/静止条件培养基分别刺激该共培养体系，特定分组加入血小板生长因子受体抑制剂(Platelet-derived growth factor receptor inhibitor, PDGFRi)，分为无条件培养基对照组、牵张条件培养基组、静止条件培养基组、牵张条件培养基+PDGFRi组、静止条件培养基+PDGFRi组。48h后收集各组细胞培养上清和蛋白，蛋白质印迹法检测EMT标记蛋白表达，酶联免疫吸附法检测各组上清中PDGF水平。
结果
1、24h牵张诱导肺上皮细胞产生促M1极化的细胞因子(IFN-γ,TNF-αandGM-CSF)增加(与静止组相比，P＜0.05)。48h牵张/静止组间促M1极化的细胞因子表达水平无显著差异。24h牵张组促M2极化细胞因子IL-4及IL-6的表达明显增加，48h牵张组的IL-6水平明显高于静止组(与静止组相比，P＜0.05)。
2、肺上皮细胞牵张24h或者48h条件培养基均能诱导M0巨噬细胞高表达M1表面标记物CD197，但仅牵张48h条件培养基组能显著增加M2标志物CD206的表达。
3、单纯牵张组条件培养基或者静止组条件培养基刺激BEAS-2B细胞，无EMT发生。在M0巨噬细胞和BEAS-2B细胞共培养体系中，牵张条件培养基组上皮标记蛋白E-cadherin、CK-8表达下降，而间质标记蛋白α-SMA、N-cadherin表达增高，这提示共培养体系中BEAS-2B细胞发生EMT；牵张条件培养基组上清中PDGF表达水平明显增高(vs静止条件培养基组，P＜0.05)；在牵张条件培养基组加入PDGFRi逆转EMT。
结论
机械牵张诱导肺上皮细胞旁分泌促M1/M2极化因子，促使巨噬细胞向M1和M2极化。极化的巨噬细胞通过释放PDGF促进人肺上皮细胞间质转分化。阻断PDGF能减轻VILI相关性肺纤维化。