肝郁证是由于情志所伤,肝失条达、气失疏泄而致肝气郁结的一类病证。肝喜条达,若七情过极导致情志失调,日久必会导致气血失调。白芍甘补酸收,为中医常用补血药,具有“养血柔肝解郁”功效,既能养肝血,又能柔肝体,最能顺应肝之特性。柔肝解郁,是白芍作为补血药临床应用的一个重要特色。白芍与赤芍均来源于毛茛科植物,二者主要来源物种一致。《中国药典》均以芍药苷作为二者质量控制指标,规定白芍含芍药苷不少于1.2%,赤芍含芍药苷不少于1.8%。研究证明芍药苷具有良好的补血、抗抑郁、镇痛等作用,是白芍“养血敛阴、柔肝解郁”功效的物质基础。临床常用白芍治疗情志类疾病,如含有白芍的经典治疗肝郁证的方剂逍遥散,研究表明芍药苷为有效成分之一。白芍和赤芍来源相近、化学成分相似,二者中医功效的不同必然有导致功效差异的不同的化学成分。课题组研究发现,芍药内酯苷为白芍区别于赤芍的特征有效成分,在白芍中含量仅次于同分异构体芍药苷,而在赤芍中几乎不含。由于芍药内酯苷难于分离纯化,对其药理研究报道相对较少,近年引起关注。研究表明,芍药内酯苷具有补血、镇痛、抗抑郁等多种活性,但目前对于芍药内酯苷通过调节NO介导的线粒体能量代谢途径发挥抗应激作用的研究还是空白。肝郁证的主要病因为情志内伤,肝失疏泄是主要的病机之一。现代医学认为,肝失疏泄功能的失调与机体受到应激刺激后,机体内环境包括神经-内分泌-免疫网络平衡的失调有关。下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）是机体处理应激反应的核心,机体受到应激,HPA轴持续亢进,不仅参与了中枢神经系统单胺类神经递质分泌与释放,而且释放的大量糖皮质激素又能进一步诱发谷氨酸堆积。大量的谷氨酸不仅会诱发神经毒性引起海马神经元凋亡,还能激活NMDA受体,激活一氧化氮合酶（NOS）,生成一氧化氮（NO）。NO扩散到相邻细胞,激活鸟苷酸环化酶（sGC）,生成cGMP,发挥多种生理效应;而高浓度的NO又会由于自身的自由基效应,引起线粒体功能障碍,最终导致神经细胞凋亡。因此,本研究以白芍“柔肝解郁”功效为指导,针对芍药内酯苷是白芍的特征有效成分,以自有芍药内酯苷分离纯化专利技术为支撑,采用慢性束缚应激致肝郁证大鼠模型以及皮质酮诱导PC12细胞损伤模型,从动物、细胞不同层面深入研究了芍药内酯苷抗应激作用机制。1 文献综述1.1 肝郁证与现代慢性应激研究进展系统梳理了肝郁“情志致病”与现代应激理论的关系,慢性应激引起海马损伤机理,以及白芍主要成分抗应激作用研究进展,为本研究奠定了理论和文献基础。1.2 一氧化氮在中枢神经系统中的作用机制研究进展系统梳理了 NO在中枢神经系统中的作用和作用机制研究进展,NO引起神经细胞凋亡研究进展,为本研究提供了现代药理学依据。1.3 芍药苷、芍药内酯苷作用于神经系统研究进展截止2016年12月,通过检索PUBMED芍药苷、芍药内酯苷作用于神经系统相关文献,系统整理芍药苷、芍药内酯苷作用于神经系统疾病的药理作用,并对药理作用机制分为细胞机制与分子机制进行汇总分析,为本研究提供现代研究思路和科学借鉴意义。2 实验研究2.1 芍药内酯苷对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠抗应激作用研究目的:采用慢性束缚应激大鼠模型,以白芍提取物、逍遥丸（含白芍方剂）、芍药苷以及氟西汀为阳性对照,研究芍药内酯苷（AF）对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠的抗应激作用。方法:80只SD大鼠随机分为8组,即空白组、模型组、白芍提取物组、逍遥丸组、氟西汀组、芍药苷组、AF30mg/kg组以及AF15mg/kg组;通过检测并记录大鼠体质量变化、糖水摄取偏好值变化、旷场实验自主行为变化、高架十字迷宫进入开放臂次数%（OAE%）以及进入开放臂时间%（OAT%）变化。结果:芍药内酯苷能够改善慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠焦虑、抑郁状态,增加体质量（P＜0.05）;改善应激大鼠在敞箱实验穿行次数（P＜0.01）与滞留时间（P＜0.05、P＜0.01）;改善应激大鼠 OAE%（P＜0.05）与 OAT%（P＜0.001、P＜0.01）。结论:芍药内酯苷能够改善慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠焦虑、抑郁状态,增加体质量,改善自主行为、探究行为,能够降低应激大鼠紧张度,具有抗应激作用。2.2 芍药内酯苷对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠HPA轴、单胺类神经递质以及海马5-HT1A、5-HT2A受体作用研究目的:采用慢性束缚应激大鼠模型,以逍遥丸（含白芍方剂）、芍药苷以及氟西汀为阳性对照,研究芍药内酯苷（AF）对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠的HPA轴激素水平、脑内单胺类神经递质含量、5-HT1AR和5-HT2AR mRNA以及蛋白表达。方法:70只SD大鼠随机分为7组,即空白组、模型组、逍遥丸组、氟西汀组、芍药苷组、AF30mg/kg组以及AF15mg/kg组;通过采用Elisa法检测HPA轴激素水平;高效液相色谱-电化学法检测脑内单胺类神经递质含量;RT-qPCR检测海马5-HT1AR和5-HT2AR受体mRNA表达以及Western Blot检测海马5-HT1AR和5-HT2AR蛋白表达。结果:芍药内酯苷能够调节5-HT等神经递质（P＜0.01,P＜0.001）的分泌,调节海马5-HT2AR蛋白表达（P＜0.05、P＜0.01）,调节BDNF的表达（P＜0.001）。结论:芍药内酯苷能够通过调节慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠海马5-HT1AR调节5-HT等神经递质的分泌,还能通过调节海马5-HT2AR进一步调节BDNF的表达,发挥神经保护作用。2.3 芍药内酯苷对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠海马BDNF及NO/cGMP信号通路的作用研究目的:通过研究海马BDNF含量和蛋白表达以及NO/cGMP信号通路靶点含量、基因及蛋白表达变化,探讨芍药内酯苷（AF）对慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠抗应激作用机制。方法:采用Griess法、Elisa法检测大鼠海马中NO含量、cGMP、BDNF含量;RT-qPCR检测海马iNOS和nNOS mRNA表达;Western Blot检测海马iNOS、nNOS、BDNF蛋白表达。结果:芍药内酯苷能够调节慢性束缚应激致肝郁证模型大鼠海马NO含量（P＜0.05）而拮抗由NO引起的能量耗竭而死亡的分子机制,降低nNOS mRNA的表达（P＜0.05）降低cGMP含量（P＜0.01）;通过调节NO/cGMP信号通路进一步调控BDNF的表达（P＜0.001）发挥神经保护作用。结论:芍药内酯苷既能通过调节应激大鼠海马NO含量拮抗由NO引起的能量耗竭,也能通过调节NO/cGMP信号通路进一步调控BDNF的表达而发挥神经保护作用。2.4 芍药内酯苷对皮质酮致PC12细胞损伤模型的神经保护作用研究目的:采用皮质酮致PC12细胞损伤模型,研究芍药内酯苷的神经保护作用。方法:通过采用CCK8法、细胞中LDH的释放、Hoechst33342染色、Tunnel染色等检测方法,从细胞存活率的改变、活细胞/死细胞形态的染色等方面,运用多种药效学检测方法证明了芍药内酯苷（AF）对皮质酮诱导PC12细胞损伤模型的神经保护作用。结果:芍药内酯苷具有良好的抗细胞凋亡活性,能够提高皮质酮诱导的PC12细胞的存活率（P＜0.01）;芍药内酯苷通过降低细胞中由皮质酮损伤所致增高的LDH含量（P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05）、ROS 含量（P＜0.001）,降低经 Hoechst33342 染色（P＜0.05）和Tunnel染色（P＜0.05）检测的凋亡的细胞数。结论:芍药内酯苷对皮质酮诱导PC12细胞损伤模型,具有显著的抗细胞凋亡活性。2.5芍药内酯苷对皮质酮致PC12细胞损伤模型线粒体介导的凋亡通路作用机制研究目的:采用皮质酮致PC12细胞损伤模型,深入研究芍药内酯苷对线粒体介导的细胞凋亡通路作用机制研究。方法:通过采用DCFH-DA法检测ROS含量、Fura-2/AM法检测Ca2+含量、钙绿黄素和CoCl2检测线粒体转换孔开放、JC-1法检测线粒体膜电位改变等检测方法,从线粒体凋亡通路以及氧化应激方面,研究芍药内酯苷（AF）抗细胞凋亡作用机制。结果:芍药内酯苷能够调节线粒体膜电位（P＜0.05）和通透性转运孔的异常开放,同时减少由应激所致高浓度细胞内Ca2+浓度（P＜0.01、P＜0.05）。从Western Blot的结果来看,芍药内酯苷能够降低促凋亡蛋白Bax的蛋白表达（P＜0.05）,从而抑制细胞核中DNA的裂解,发挥抗凋亡的作用。结论:芍药内酯苷能通过降低细胞中由皮质酮刺激增高的ROS含量,调节线粒体膜电位和通透性转运孔的异常开放,还可减少由应激所致高浓度细胞内Ca2+浓度,并能够在一定程度上逆转由于氧化应激诱导的Caspase蛋白家族的级联反应,从而抑制细胞核中DNA的裂解,发挥抗凋亡的作用。2.6芍药内酯苷对皮质酮致PC12细胞损伤模型对NO/cGMP信号通路作用机制研究目的:采用皮质酮致PC12细胞损伤模型,深入研究芍药内酯苷（AF）通过NO介导的线粒体能量代谢途径发挥神经保护作用的机制及通过调控NO/cGMP信号通路对于线粒体活性功能的影响。方法:通过采用DAF-FM/DA法检测NO含量、Elisa法检测3-NT蛋白浓度以及cGMP含量、RT-qPCR法检测iNOS和nNOS的mRNA表达、Western Blot法检测Caspase3以及Caspase9蛋白的表达,运用多种方法证明了芍药内酯苷能够通过调节NO介导的线粒体凋亡路径发挥神经保护作用。结果:芍药内酯苷一方面能够下调细胞内NO含量（P＜0.001、P＜0.01、P＜0.001）,拮抗由于NO升高导致的线粒体膜电位降低导致促凋亡蛋白Bax的上调,使线粒体膜通透性增高以及激活的Caspase依赖的细胞凋亡信号通道所引起细胞凋亡,下调Caspase 3（P＜0.05）和Caspase 9（P＜0.01、P＜0.001）的蛋白表达;另一方面也证明了芍药内酯苷能够降低cGMP含量（P＜0.05）,通过NO/cGMP信号途径改善线粒体的生物功能,以保证生物体内能量的生成及供给,抑制细胞的凋亡。结论:芍药内酯苷一方面能够作用于NO介导的线粒体凋亡路径发挥抗凋亡作用;另一方面能够通过NO/cGMP信号途径发挥神经保护作用。3结语本论文结合了中药药性理论与现代药理技术,以白芍的中医特色功效为依据,以自有有效成分提取分离专利技术为支撑,对芍药内酯苷抗应激作用机制从动物、细胞不同层面进行全面研究。研究揭示了芍药内酯苷为白芍“柔肝解郁”功效的物质基础,丰富了中药基础理论的科学内涵,为白芍的临床应用、质量标准的建立以及工业生产提供药理学实验依据。