电生理信息在油菜和诸葛菜菌核病预测防治中的应用

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菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)引起的一种植物真菌病害,宿主范围广、破坏性极强,是油菜(Brassica napus L.)和诸葛菜(Orychophragmus violaceus)上危害最严重的病害。植物源和菌源有机物为核盘菌致病进程中重要的致病因子,当前仍难以定量致病有机物的来源贡献及核盘菌侵染能力。菌核净是油菜和诸葛菜生产中防控菌核病的常用药剂,但其广泛和不当的应用对生态环境、野生动物和人类构成了潜在的威胁。因此,建立快速准确的菌核病早期预测方法、解析致病有机物的致病作用和核盘菌侵染能力及开发高效的菌核净残留降解技术对油菜和诸葛菜菌核病的高效、安全、生态防控具有重要意义。本文以甘蓝型油菜和诸葛菜为研究对象,研究了电生理信息在油菜、诸葛菜菌核病预测防治中的应用。主要结论如下:(1)探明了核盘菌侵染及核盘菌与致病有机物(草酸,OA)复合侵染下苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的引起电生理信息变化的细胞膜透性、膜脂氧化、抗氧化酶活性和草酸等参数响应,明确了电生理信息应用于菌核病早期预测的生理生化基础。以苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜为研究对象,采用核盘菌接种及核盘菌与OA复合接种侵染叶片,测定了不同侵染时间的油菜和诸葛菜生理生化参数。结果表明核盘菌侵染极显著地(p?0.01)提高了苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜叶片的电导率(EC)、离子外渗百分率、超氧阴离子产生率、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和OA含量,且随着核盘菌接种量的增加,它们的升高幅度逐渐增加。整体上,苗期油菜和花期油菜叶片的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)活性在核盘菌侵染后极显著地(p?0.01)降低,同时核盘菌侵染极显著地(p?0.01)降低了花期诸葛菜叶片的SOD、POD与PPO活性并提高了其CAT活性。0.10 m M OA促进了核盘菌对苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的细胞膜透性、膜脂氧化、抗氧化酶活性和草酸侵染响应。核盘菌侵染下苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的细胞膜透性、膜脂氧化、抗氧化酶活性和草酸响应明显,其势必伴随着它们电生理信息的明显响应,这也提示了植物电生理信息应用于油菜和诸葛菜菌核病早期预测的可行性。(2)建立了油菜和诸葛菜固有电生理信息以及胞内水代谢和营养转运信息的获取技术。基于能斯特方程和吉布斯自由能,揭示了夹持力(F)与植物电容(C)和电阻(R)、阻抗(Z)、容抗(Xc)或感抗(XL)之间的理论关系为C=y0+k0F和R、Z、Xc或XL=y,通过拟合方程获得了叶片固有C、R、Z、Xc和XL。随后,基于植物固有电生理信息定义植物叶片细胞内水分利用参数(细胞持水量IWHC、胞内水利用效率IWUE、细胞持水时间IWHT和胞内水转移速率WTR)和营养转运参数(营养单位转运量UNF、营养单位主动转运量UAF、营养转运速率NTR、营养转运能力NTC和营养主动转运能力UAC),并对不同植物电生理信息、细胞内水分代谢和营养转运等进行评价。结果表明植物固有电生理信息C、R、Z、Xc和XL能准确地表征了油菜、诸葛菜以及其它植物的生理状态,且IWHC、IWUE、WTR、UNF、UAF、NTR、NTC和UAC能准确地揭示和表征油菜、诸葛菜以及其它植物胞内水利用策略和营养转运策略。研究为电生理信息应用于油菜和诸葛菜菌核病早期预测提供了技术支撑。(3)明确了核盘菌侵染及核盘菌与OA复合侵染下苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜电生理信息以及胞内水代谢和营养转运的响应,提出了基于电生理信息的菌核病早期预测方法。以苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜为研究对象,采用核盘菌接种及核盘菌与OA复合接种侵染叶片,测定了不同侵染时间的油菜和诸葛菜电生理参数。结果表明核盘菌侵染极显著地(p?0.01)降低了苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的C、IWHC、WTR(或NTR)、UAC和NTC,同时极显著地(p?0.01)提高了苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的Z、R、Xc和XL;且随着核盘菌接种量的增加,C、IWHC、WTR(或NTR)、UAC和NTC的降低幅度以及Z、R、Xc和XL的升高幅度逐渐增强。0.10 m M OA促进了核盘菌对苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的侵染。核盘菌侵染苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜后的电生理信息、胞内水代谢信息和营养转运信息等的显著变化至少要比肉眼可见的菌核病症状提前2~4天。健康的苗期油菜、花期油菜和花期诸葛菜的C、Z、R、Xc、XL、IWHC、WTR(或NTR)、UAC和NTC(160.71~249.04 p F、0.16~0.19M?、0.17~0.29 M?、0.22~0.34 M?、0.31~0.49 M?、2050.54~3952.76、72.48~92.22、42.31~71.04和86.47~149.27,165.37~199.97 p F、0.12~0.18 M?、0.13~0.18 M?、0.22~0.32 M?、0.30~0.48 M?、2126.61~2820.36、82.59~119.13、57.48~94.40和63.64~125.22,489.36~606.53 p F、0.07~0.08 M?、0.05~0.11 M?、0.09~0.11 M?和0.06~0.18 M?、10833.99~14718.28、294.57~407.94、171.19~203.37和445.12~577.23)可作为它们健康阈值或疾病指标,结合早期菌核病症状预测油菜和诸葛菜菌核病。(4)解析了植物源致病有机物在致病作用及核盘菌对油菜和诸葛菜侵染能力,佐证了电生理信息应用于油菜、诸葛菜菌核病早期预测的可行性。以油菜和诸葛菜为研究对象,利用稳定碳同位素值差异较大的甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖建立双向同位素示踪培养体系,用甘蔗蔗糖和甜菜蔗糖培养的核盘菌交替感染甘蔗蔗糖和甜菜蔗糖培养的待测植物,侵染体系置于高δ13C值(30‰)的蔗糖培养基中培养。结果表明随着侵染时间的延长(72 h内),核盘菌-油菜(或诸葛菜)叶体系中的δ13C值和稳定碳同位素分馏值以及核盘菌增殖系数逐渐增加,表明核盘菌侵染油菜和诸葛菜进程中植物源致病有机物的致病作用随侵染时间延长逐渐增大。基于稳定碳同位素分馏值和核盘菌增殖系数建立的病级数Si可以很好地表征核盘菌对油菜和诸葛菜侵染能力,核盘菌侵染油菜感病符合2参数单矩形双曲线模型Si=1.9495 t/(8.8600+t),R~2=0.9997,p<0.0001,而核盘菌侵染诸葛菜则符合指数增长模型Si=0.1920 e 0.0391 t,R~2=0.9851,p=0.0030,表明诸葛菜与油菜具有不同感病特征且诸葛菜比油菜更易感菌核病;这与核盘菌侵染诸葛菜的电生理显著变化要比侵染油菜的电生理显著变化快的结果相一致,很好地佐证了基于电生理信息的油菜、诸葛菜菌核病早期预测方法的可行性。(5)评价了基于电生理信息的菌核病早期预测方法对田间油菜和诸葛菜菌核病的预测防治效果。调查了预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜菌核病的病情指数、防治效果和农药(菌核净)用量。结果表明喷施核盘菌菌液2天(或1天)后,相对于喷施前的电生理信息、胞内水代谢信息和营养转运信息或上述的健康阈值,油菜(或诸葛菜)的C、IWHC、WTR(或NTR)、UAC和NTC极显著(p?0.01)降低,Z、R、Xc和XL极显著(p?0.01)升高;说明此时核盘菌已经开始侵染油菜和诸葛菜,并于此时开展菌核病喷施菌核净防治。此外,油菜、诸葛菜的电生理信息、胞内水代谢信息和营养转运信息发生显著变化比表观症状分别提前了3~4天和2~3天。在喷施菌核净防治7天后,预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜菌核病的防治效果分别为91.07%和68.42%、87.73%和69.27%,且预测防治区施用的菌核净剂量为常规防治区的一半。(6)探明了斯氏普罗威登斯菌JD(Providencia stuartii JD)和单孢属菌J3(Brevundimonas naejangsanensis J3)共培养对防治菌核病农药-菌核净的降解作用,评价了游离或固定化JD-J3混合菌剂对油菜、诸葛菜和土壤中菌核净的生物降解性能,研制了菌核净残留降解的生物产品。结果表明JD-J3混合菌对50 mg/L菌核净在5 d内的降解率可达85.56%,分别是JD和J3单菌降解的1.23倍和1.26倍。JD-J3混合菌降解MSM中菌核净的最优条件为p H 7.0、30℃、6.5×10~8 cfu/m L的混合菌和50 mg/L的菌核净。JD-J3混合菌可水解菌核净成3,5-二氯苯胺和丁二酸,3,5-二氯苯胺进一步被转化为苯酚,苯酚进一步被氧化为己二烯二酸,丁二酸和己二烯二酸最后被矿化。此外,炭-海藻酸-壳聚糖载体固定化的混合菌在降解性、稳定性和可重复使用性方面明显优于游离混合菌。通过降解性能评价试验发现游离JD-J3混合菌能高效去除油菜和诸葛菜中的高残留菌核净,与自然耗散相比,其对油菜和诸葛菜中菌核净残留半衰期可分别有效降低2.22倍和2.42倍;与游离混合菌和自然耗散相比,固定化JD-J3混合菌显著加块了土壤中高残留菌核净的降解。研究为菌核净污染植物和土壤的原位修复提供了可行的、高效的、快速的生物产品。(7)明确了游离或固定化JD-J3混合菌剂对原位油菜、诸葛菜和土壤中菌核净的生物修复作用。以油菜、诸葛菜以及它们的种植土壤为研究对象,评价了游离或固定化JD-J3混合菌剂对预测防治区和常规防治区的油菜和诸葛菜以及其种植土壤中菌核净残留的生物修复作用。结果表明预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜在喷施游离JD-J3混合菌剂60 h后,油菜植株中100%和98.56%的菌核净残留被分别去除,诸葛菜植株中几乎所有的菌核净残留均被去除;与自然耗散相比,游离JD-J3混合菌剂对预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜中菌核净残留半衰期可分别有效降低4.40倍和3.20倍、4.60倍和3.34倍。预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜种植土壤在施用固定化JD-J3混合菌剂60 h后,油菜种植土壤中99.66%和98.33%的菌核净被分别去除、诸葛菜种植土壤中98.96%和98.03%的菌核净被分别去除。与自然耗散相比,固定化JD-J3混合菌剂对预测防治区和常规防治区油菜、诸葛菜种植土壤中菌核净残留半衰期可分别有效降低3.44倍和2.78倍、3.35倍和2.27倍。研究为以油菜和诸葛菜电生理信息获取、基于电生理信息的菌核病早期预测方法建立、油菜和诸葛菜菌核病的预测与防治、菌核净高效降解菌剂制备与评价、油菜和诸葛菜及其种植土壤中菌核净残留的生物降解为一体的菌核病高效、安全、生态防控技术体系提供了参考。
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