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胰岛干细胞（Pancreatic islet stem cells,PISC）是一类成体干细胞（Adult stem cells,ASC）,在胎儿与成体胰腺组织内分布,其能够自我更新与多向分化,被当做体外β细胞再生的高品质细胞源,并且可提供材料给体外胰岛细胞移植。现今依然存在体外诱导胰腺干细胞分化为功能性胰岛的研究难题,诱导形成的类胰岛细胞对葡萄糖（Glucose,GLU）的反应性低,诱导程序复杂,不足以在临床应用等。本课题组现已自成年大鼠胰岛组织内分离培养得到1例大鼠PISC系,并对其形态、核型、多谱系潜能以及特异性基因表达等方面进行了研究。基于此,本项研究逐一对比NIC、Vit D3与INGAP单因子诱导大鼠PISC分化为胰岛β细胞的表现,并筛选出INGAP、Vit D3和NIC的最适诱导浓度;然后以INGAP、Vit D3和NIC的最适诱导浓度随机组合建立联合诱导方案。通过细胞形态观察、DTZ染色、重要转录因子的表达以及糖刺激试验系统分析INGAP、Vit D3和NIC单独及联合诱导下对大鼠胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞的影响,筛选最为适宜的诱导途径。此项研究由下述4部分内容构成:试验一:INGAP体外诱导大鼠胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞此项研究经由INGAP对大鼠PISC施以体外定向诱导,使其分化为胰岛β细胞,同时对比各诱导组,筛选INGAP的最适浓度。培养且扩增第20代大鼠PISC,向12孔板内接种（各孔皆为1×10~4个）,所接种的12孔板合计15个,扩增PISC至单层,启动诱导试验。对于此项试验,共安排对照组1个、INGAP诱导组4个,各组12孔板量皆为3个,各组重复皆为36个。对照组使用基础培养液（DMEM-F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）;试验组,向基础培养液内加入各浓度水平INGAP,试验1组添加100n M INGAP;试验2组添加150n M INGAP;试验3组添加200n M INGAP;试验4组添加250n M INGAP。连续诱导28d,借助倒置显微镜,每3d查看1次细胞生长情况,同时分别于0d、1w、2w、3w、4w时拍照记录。此外,通过DTZ染色、q PCR、细胞免疫荧光和糖刺激试验检测诱导28d后细胞的特性、Insulin和Pdx1 mRNA的表达水平、细胞内胰岛素和Pdx1的蛋白表达以及胰岛素和C肽的分泌量。结果显示:100n M、150n M、200n M和250n M INGAP均能诱导大鼠胰岛干细胞向胰岛β样细胞分化,其中以150n M INGAP诱导组产生的类胰岛细胞团最多,细胞团的形态更完整;诱导4w时,4个诱导组分化为类胰岛细胞团,经DTZ染色显示阳性;q PCR测定每个处理组Pdx1与Insulin mRNA表达量,发现皆有所提高,就细胞Insulin mRNA表达量而言,与100n M与250n M这2个浓度相比,INGAP（150n M）诱导组皆为极显著升高表现（P＜0.01）;在细胞Pdx1 mRNA表达量上,相较INGAP 100n M、200n M与250n M这3个浓度,150n M为显著偏高表现（P＜0.05）。因此,将INGAP加入至基础培养液内,能够诱导大鼠PISC分化为胰岛β细胞,最适浓度为150n M。试验二:Vit D3体外诱导大鼠胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞此项研究经由Vit D3对大鼠PISC施以体外定向诱导,使其分化为胰岛β细胞,同时对比各诱导组,筛选Vit D3的最适浓度。培养且扩增第20代大鼠PISC,向12孔板内接种（各孔皆为1×10~4个）,所接种的12孔板合计15个,扩增PISC至单层,启动诱导试验。对于此项试验,共安排对照组1个、Vit D3诱导组4个,各组12孔板量皆为3个,各组重复皆为36个。对照组使用基础培养液（DMEM-F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）;试验组在基础培养液中添加不同浓度的Vit D3,试验1组添加10-5mol/L Vit D3;试验2组添加10-6mol/L Vit D3;试验3组添加10-7mol/L Vit D3;试验4组添加10-8mol/L Vit D3。连续诱导28d,每3d查看1次细胞生长情况,同时分别于0d、1w、2w、3w、4w时拍照记录。此外,通过DTZ染色、q PCR、细胞免疫荧光和糖刺激胰岛素分泌试验检测诱导28d后细胞的特性、Insulin和Pdx1 mRNA的表达水平、细胞内胰岛素和Pdx1的蛋白表达以及胰岛素和C肽的分泌量。结果显示:10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L和10-8mol/L Vit D3处理组均能诱导胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞。诱导4w时,4个处理组DTZ染色皆显示阳性,q PCR测定不同处理组细胞Pdx1与Insulin mRNA表达量,发现皆有所提高。不同处理组组间比较,10-7mol/L Vit D3处理组Insulin和Pdx1 mRNA的表达水平显著高于10-5mol/L Vit D3处理组、10-6mol/L Vit D3处理组和10-8mol/L Vit D3处理组。在高糖和低糖的刺激下,10-7mol/L Vit D3处理组细胞胰岛素和C肽分泌水平显著高于10-5mol/L,10-6mol/L和10-8mol/L Vit D3处理组。总之,将Vit D3加入至基础培养液内,能够诱导大鼠PISC分化为胰岛β细胞,同时添加浓度最佳是10-7 mol/L。试验三:NIC体外诱导大鼠胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞此项研究经由NIC对大鼠PISC施以体外定向诱导,使其分化为胰岛β细胞,同时对比各诱导组,筛选NIC的最适浓度。培养且扩增第20代大鼠PISC,向12孔板内接种（各孔皆为1×10~4个）,所接种的12孔板合计15个,扩增PISC至单层,启动诱导试验。对于此项试验,共安排对照组1个、NIC试验组4个,各组12孔板量皆为3个,各组重复皆为36个。对照组使用基础培养液（DMEM-F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）;试验组将浓度水平不同的NIC加入至基础培养液内,试验1组添加5m M NIC;试验2组添加10m M NIC;试验3组添加15m M NIC;试验4组添加20m M NIC。连续诱导28d,每3d查看1次细胞生长情况,同时分别于0d、1w、2w、3w、4w时拍照记录。此外,通过DTZ染色、q PCR、细胞免疫荧光和糖刺激胰岛素分泌试验检测诱导28d后细胞的特性、Insulin和Pdx1 mRNA的表达水平、细胞内胰岛素和Pdx1的蛋白表达以及胰岛素和C肽的分泌量。结果显示:5m M,10m M,15m M和20m M NIC处理组均能诱导胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞,细胞聚集生长,出现直径各异的细胞团。诱导4w时,对比对照组,以10m M NIC诱导组中形成的类胰岛细胞团数量最多;NIC诱导组产生的类胰岛细胞经DTZ染色皆显示阳性,其中10m M NIC诱导组DTZ染色结果最好;q PCR测定各处理组细胞Pdx1与Insulin mRNA表达量皆有所提高。对比不同诱导组,相较于另3个诱导组,NIC（10m M）处理组细胞胰岛素（INS）与C肽生成量,还有Pdx1与Insulin mRNA表达量皆为显著偏高表现（P＜0.01）。总之,将NIC加入至基础培养液内,能够诱导大鼠PISC分化为胰岛β细胞,并且最适添加浓度为10m M。试验四:INGAP,Vit D3和NIC联合诱导大鼠胰岛干细胞分化形成胰岛β细胞此项研究经由NIC、INGAP与Vit D3最佳浓度的不同组合对大鼠PISC施以体外定向诱导,使其分化为胰岛β细胞,同时对比4个诱导组,筛选最适诱导方案。对第20代大鼠PISC施以培养、扩增,向12孔板内接种（各孔皆为1×10~4个）,所接种的12孔板合计15个,扩增PISC至单层,启动诱导试验。对于此项试验,共安排对照组1个、联合诱导组4个,各组12孔板量皆为3个,各组重复皆为36个。对照组使用基础培养液（DMEM-F12+10%FBS+1%青霉素-链霉素）;试验组在基础培养液中添加不同浓度的INGAP,Vit D3和NIC,试验1组添加10m M NIC+150n M INGAP（N+I）;试验2组添加10m M NIC+10-7mol/L Vit D3（N+V）;试验3组添加150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3（I+V）;试验4组添加10m M NIC+150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3（N+I+V）。连续诱导28d,每3d查看1次细胞生长情况,同时分别于0d、1w、2w、3w、4w时拍照记录。此外,通过DTZ染色、q PCR、细胞免疫荧光和糖刺激胰岛素分泌试验检测诱导28d后细胞的特性、Insulin和Pdx1 mRNA的表达水平、细胞内Insulin和Pdx1的蛋白表达以及胰岛素和C肽的分泌量。结果表明:经各组合的诱导发现,不同组合下皆可诱导大鼠PISC分化为胰岛β细胞。经过4w诱导,相较对照组,以N+I+V诱导组和N+V诱导组形成的类胰岛细胞团更大,形态更好;q PCR检测各诱导组细胞Insulin和Pdx1 mRNA表达水平均不同程度上调。不同诱导组组间比较,10m M NIC+150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3（N+I+V）诱导组细胞胰岛素和C肽分泌量显著高于10m M NIC+150n M INGAP（N+I）,10m M NIC+10-7mol/L Vit D3（N+V）和150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3（I+V）诱导组（P＜0.01）。综上所述,在基础培养液中添加10m M NIC+150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3形成的类胰岛细胞团更多,DTZ染色阳性率最高,Insulin与Pdx1分泌量较其它诱导组皆偏高,胰岛素和C肽的分泌量最高,因此10m M NIC+150n M INGAP+10-7mol/L Vit D3为最适诱导方案。