【摘 要】
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目的探讨Clusterin对机械应力介导黄韧带肥厚的作用和机制,为临床治疗黄韧带肥厚提供理论依据和潜在治疗靶点。方法1、临床收集肥厚黄韧带和非肥厚黄韧带组织,通过iTRAQ技术和蛋白质组学,筛选差异显著蛋白Clusterin。String蛋白质互作网络分析预测促纤维化蛋白 TGF-β1。使用 IHC、RT-PCR、Western blot 检测两组 Clusterin、TGF-β1 和纤维化标志物
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（81874013）；
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目的探讨Clusterin对机械应力介导黄韧带肥厚的作用和机制,为临床治疗黄韧带肥厚提供理论依据和潜在治疗靶点。方法1、临床收集肥厚黄韧带和非肥厚黄韧带组织,通过iTRAQ技术和蛋白质组学,筛选差异显著蛋白Clusterin。String蛋白质互作网络分析预测促纤维化蛋白 TGF-β1。使用 IHC、RT-PCR、Western blot 检测两组 Clusterin、TGF-β1 和纤维化标志物COL1A2、α-SMA的表达。2、体外通过Flexcell FX-5000系统构建机械应力-黄韧带肥厚细胞模型,使用 IF、RT-PCR、ELISA检测 Clusterin、TGF-β1、COL1A2、α-SMA 的表达。3、体外通过TGF-β1构建炎症介质-黄韧带肥厚细胞模型,观察重组Clusterin蛋白对TGF-β1介导黄韧带肥厚的影响,使用IF、RT-PCR、Western blot检测SMAD3通路磷酸化及COL1A2、α-SMA的表达。4、过表达或者沉默ALK5,观察重组Clusterin蛋白和（或）TGF-β1介导黄韧带成纤维细胞的影响,使用Western blot检测SMAD3通路磷酸化及COL1A2、α-SMA的表达。5、过表达或者沉默PRKD3或者使用PRKD3抑制剂CRT0066101,检测PRKD3对Clusterin基因、蛋白、功能的影响。使用IF、RT-PCR、Western blot检测COL1A2和α-SMA的表达。6、小鼠体内构建机械应力-黄韧带肥厚模型,尾静脉注射重组Clusterin蛋白,观察Clusterin对黄韧带肥厚的影响,使用HE染色检测黄韧带的面积;使用EVG、Masson染色检测黄韧带胶原纤维/弹性纤维比例;使用IHC检测SMAD3通路磷酸化及纤维化代谢产物α-SMA的表达。7、临床收集肥厚黄韧带患者和非肥厚黄韧带患者的血清样本,使用ELISA检测血清中Clusterin和PRKD3蛋白含量。结果1、高通量筛选差异显著蛋白Clusterin,在肥厚黄韧带显著升高,Fold Chang=30.33,P=2.20E-09。Clusterin通过String蛋白质互作网络分析预测促纤维化蛋白TGF-β1。在肥厚的黄韧带中Clusterin、TGF-β1和纤维化标志物COL1A2、α-SMA的表达显著升高,差异有统计学意义。2、黄韧带细胞在异常机械应力下Clusterin、TGF-β1、COL1A2、α-SMA的基因和蛋白显著升高,差异有统计学意义。3、重组Clusterin蛋白抑制TGF-β1介导黄韧带成纤维细胞纤维化,降低SMAD3通路磷酸化及COL1A2、α-SMA的表达。4、过表达ALK5增强TGF-β1介导黄韧带成纤维细胞纤维化,沉默ALK5降低TGF-β1介导黄韧带成纤维细胞纤维化。重组Clusterin蛋白降低TGF-β1介导黄韧带成纤维细胞纤维化,重组Clusterin蛋白不影响没有TGF-β1介导的黄韧带成纤维细胞纤维化。5、沉默PRKD3抑制溶酶体降解Clusterin蛋白,但不影响Clusterin mRNA,溶酶体降解Clusterin蛋白后丧失其生物学活性。6、重组Clusterin蛋白体内减轻机械应力介导的黄韧带纤维化。7、人体血清Clusterin和PRKD3蛋白浓度在两组患者中没有显著差异,Clusterin蛋白在黄韧带局部起作用。结论Clusterin在体内外均通过抑制TGF-β1/ALK5/SMAD3信号通路减轻机械应力介导的黄韧带肥厚。
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