原发性肝癌是起病隐匿并且生长较为迅速的消化系统恶性肿瘤。我国是肝癌的高发地区,全球肝癌新发病例中的50%以上都在我国,其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。由于早期无症状或症状不典型,多数肝癌患者在确诊时已进展至中晚期,此时尽管积极采取手术治疗,但肿瘤复发转移仍是肝癌导致死亡的重要原因。研究表明肝癌的发生与乙肝、丙肝病毒感染、自身免疫性肝病、过量饮酒及摄入黄曲霉素污染的食物等有密切关系。基因突变在肝癌中广泛存在,癌基因过度表达,肿瘤抑制基因失活是导致肝细胞癌变的重要原因。目前肝癌发生发展的分子机制,分子间的交互作用尚未完全阐明,因此,深入探讨肝癌发展的分子机制和关键调控环节,寻找早期诊断和判断预后分子标志物以及治疗肝癌的有效靶点,对进一步提高我国肝癌的诊疗水平具有重要意义。烯醇化酶（ENO）在糖酵解代谢途径中,可催化2-磷酸甘油酸脱水进而生成磷酸烯醇式丙酮酸。在哺乳动物中,分别由三种不同的基因对应着其编码的烯醇化酶同工酶,分别包含了三个不同的亚基结构α、β和γ,γ-烯醇化酶即为ENO3。肌肉特异性烯醇化酶（ENO3）是ENO三种同工酶之一,主要在骨骼肌和肝脏中表达,与糖原代谢、脂质代谢密切相关。研究显示,ENO3表达缺失可能导致糖原代谢障碍,进而引起代谢性肌病;其还可介导胆固醇合成,引起的肝脏胆固醇积累,在肥胖患者及非酒精性脂肪肝患者中ENO3表达增加。越来越多的证据表明,代谢相关催化酶可以直接或间接地改变癌基因表达,从而影响肿瘤进展。ENO3在多种肿瘤组织中异常表达。在STK11基因突变的小细胞肺癌和结直肠癌中ENO3表达上调。而在胰腺癌中和肝细胞癌中ENO3则表达下调,并且低表达的ENO3的患者预后较差。肝星状细胞长期过度激活可导致肝纤维化和肝硬化,在肝硬化的基础上进而诱发肝癌。在激活的肝星状细胞中,同样发现ENO3显著下调。这些证据预示ENO3不仅可以催化肝细胞代谢过程,而且可能在早期肝癌的发生发展中起重要作用。然而,目前仍缺乏ENO3在肝癌发生发展中的作用相关研究,其具体作用及潜在机制尚未得到探索。因此,本研究旨在揭示ENO3在肝癌发生发展的作用及机制,以期为肝癌的早期诊断、临床靶向治疗和预后判断提供理论依据。目的1.探究ENO3在肝细胞癌组织及与之匹配的癌旁（正常）肝组织中的表达并分析其与预后的关系。2.通过体内外实验探究ENO3对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移以及侵袭能力的影响。3.探究ENO3影响肝癌细胞恶性生物学行为的分子机制。方法1.利用TCGA数据库374个肿瘤标本和50个正常标本以及ICGC数据库212个肿瘤标本和177个正常标本,用R语言分析ENO3的表达以及其与患者预后的关系。2.收集62对肝细胞癌患者癌组织标本及与之匹配的癌旁（正常）肝组织。采用实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）,免疫印迹法（Western blot,WB）和免疫组织化学染色法（Immunohistochemistry,IHC）分别检测ENO3在肝癌组织、正常肝组织以及不同肝癌细胞系中mRNA和蛋白的表达。3.借助过表达质粒和小干扰 RNA（Small interfering RNA,siRNA）在 MHCC97H和HepG2细胞中同时过表达/敲低ENO3。4.过表达/敲低ENO3后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,克隆形成法检测细胞克隆形成能力。划痕法、Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力。WB法检测过表达/敲低ENO3后,EMT相关蛋白的变化。5.过表达/敲低ENO3后,采用WB法检测对JAK/STAT,PI3K/AKT,以及Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白及其磷酸化蛋白表达水平的影响。6.过表达/敲低ENO3后,采用WB法检测检测对GSK-3β/p-GSK-3β、细胞核内β-catenin的表达水平以及Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的影响。7.过表达ENO3抑制Wnt/β-catenin信号通路,采用小分子化合物CHIR-99021重新激活的MHCC97H细胞的Wnt/β-catenin信号,检测细胞的增殖和迁移能力。8.构建裸鼠皮下成瘤模型和尾静脉注射肺转移模型,将稳定过表达ENO3的MHCC97H细胞分别注射到裸鼠皮下及尾静脉,观察ENO3在裸鼠体内对肝癌细胞增殖和转移的影响。结果1.ENO3在TCGA数据库与ICGC数据库的肝癌组织样本以及本中心获取的肝癌组织样本中表达均明显降低,且低表达ENO3患者有不良预后。2.ENO3在不同肝癌细胞系中表达水平不同,在HepG2细胞中表达相对较低,在MHCC97H细胞中表达相对较高。3.过表达ENO3后,MHCC97H和HepG2细胞增殖能力,克隆形成能力,细胞迁移和侵袭能力下降;敲低ENO3后,MHCC97H和HepG2细胞增殖能力,克隆形成能力,细胞迁移和侵袭能力提高。4.ENO3可以通过抑制EMT过程影响细胞迁移和侵袭能力。5.过表达ENO3可以显著下调细胞总β-catenin表达,然而对STAT3、P-STAT3、AKT、P-AKT无影响,敲低ENO3后结果相反。6.过表达ENO3可以下调P-GSK-3β水平,但对GSK-3β无影响;可以使细胞细胞核内β-catenin 和 Wnt/β-catenin 信号通路下游靶基因 C-myc,Cyclin D1,MMP2,MMP7和MMP9表达下降,敲低ENO3后结果相反。7.Wnt/β-catenin通路激动剂CHIR-99021可以逆转ENO3对肝癌细胞增殖、迁移能力的抑制作用。8.过表达ENO3可显著减缓肿瘤的生长速度,同时有效减少肺部肿瘤转移灶数目。结论1.ENO3在肝癌组织中表达降低,且低表达患者有较差预后。2.ENO3可以在（体内）和（体外）抑制肝癌细胞增殖和转移能力。3.ENO3通过负向调控Wnt/β-catenin信号通路,抑制肝细胞癌发生发展。