【摘 要】
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一、前言衰老相关的骨重建失衡造成的骨丢失是老年性骨质疏松的主要原因。与骨吸收相比,衰老相关的骨丢失主要是由骨形成受损引起的。衰老会损害前成骨细胞的增殖及其分化为成熟的成骨细胞的能力,从而破坏骨形成。因此,前成骨细胞衰老是衰老相关骨丢失的一个关键靶点。本课题组之前报道了 mTORC调控前成骨细胞功能对骨发育的作用和机制;然而,mTORC1在前成骨细胞衰老和老年性骨质疏松的作用和具体机制尚未阐明。二、
【基金项目】
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国家自然科学基金委员会青年基金项目（81700783）；
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一、前言衰老相关的骨重建失衡造成的骨丢失是老年性骨质疏松的主要原因。与骨吸收相比,衰老相关的骨丢失主要是由骨形成受损引起的。衰老会损害前成骨细胞的增殖及其分化为成熟的成骨细胞的能力,从而破坏骨形成。因此,前成骨细胞衰老是衰老相关骨丢失的一个关键靶点。本课题组之前报道了 mTORC调控前成骨细胞功能对骨发育的作用和机制;然而,mTORC1在前成骨细胞衰老和老年性骨质疏松的作用和具体机制尚未阐明。二、目的及意义本研究通过揭示mTORC1调控前成骨细胞衰老的机制,为研究衰老相关骨丢失和老年性骨质疏松提出有希望的靶点。对相关途径和药物的药学研究可能会为衰老相关骨丢失提供潜在的治疗方法。三、方法与内容为了明确mTORC1在前成骨细胞衰老过程中的作用,构建老年阶段特异性的前成骨细胞mTORC1激活（ΔTsc1）和失活（ΔRaptor）小鼠模型,micro-CT检测定量分析骨量变化,免疫学染色观察相应动物模型骨内细胞数量及衰老表型的改变;体外验证,提取原代成骨细胞并用ROS诱导衰老,检测mTORC1激活和失活对前成骨细胞衰老表型的不同影响。探讨mTORC1调控细胞膜去极化的机制:①用荧光染料DiBAC4（3）孵育ROS诱导衰老的ΔTsc1和ΔRaptor前成骨细胞,检测mTORC1激活和失活对细胞膜电位的不同影响;②抑制衰老的ΔTsc1前成骨细胞的细胞膜去极化,诱导衰老的ΔRaptor前成骨细胞的细胞膜去极化,分别检测控制细胞膜电位对衰老表型的改变;③qPCR和免疫印迹检测ΔTsc1和ΔRaptor前成骨细胞Scn1a、C/EBPα的表达,并验证mTORC1对Scn1a与C/EBPα之间结合的作用;siScn1a转染,检测其对细胞膜电位和衰老表型的影响;④分别用PKA激活剂和抑制剂处理细胞,检测细胞膜电位和衰老表型的变化;调节膜电位,检测衰老的ΔTsc1和ΔRaptor前成骨细胞内Ca2+水平、NFATc1的核定位和表达量变化。应用BAPTA-AM处理ΔTsc1前成骨细胞后衰老表型的变化,探究细胞膜电位调控前成骨细胞衰老的机制。四、结果1、年轻ΔRaptor小鼠的骨量较同窝对照组底,老年ΔRaptor小鼠的骨量较同窝对照组高。2、前成骨细胞衰老过程中,mTORC1活性升高。3、激活mTORC1促进前成骨细胞的衰老,而抑制mTORC1延缓前成骨细胞的衰老。4、衰老加速的ΔTsc1前成骨细胞的去极化增强,而ΔRaptor前成骨细胞的去极化降低。5、阻止ΔTsc1前成骨细胞去极化,其细胞衰老程度减轻;强制去极化的ΔRaptor前成骨细胞抵消了 mTORC1失活对细胞衰老的有益作用。6、mTORC1正调控Scn1a;下调Scn1a的表达减轻了衰老Δtsc1前成骨细胞的去极化。PKA激活剂可减轻前成骨细胞衰老及去极化;PKA抑制剂可诱导及加重细胞衰老及去极化。7、细胞膜去极化通过增加Ca2+内流从而促进NFAT在细胞核的表达,进而通过ATF3/p53信号导致前成骨细胞衰老。五、结论1、mTORC1通过调控细胞膜电位诱导前成骨细胞衰老。2、mTORC1通过促进Scn1a转录调控细胞膜去极化,而Scn1a对Na+的通透性受PKA的门控调节。3、细胞膜去极化通过Ca2+/NFAT/ATF3/p53信号通路诱导前成骨细胞衰老。4、本研究初步阐明了 mTORC1对前成骨细胞衰老的作用和具体机制,mTORC1-Scn1a-膜电位有望成为治疗衰老相关骨丢失和老年性骨质疏松的新靶标。
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