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背景越来越多研究表明细胞焦亡,尤其是小胶质细胞焦亡,在中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病,包括创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）,发病机制中发挥重要作用。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）移植一直是治疗脑损伤的研究热点。近年来,更有研究发现MSC通过调控细胞焦亡途径在多种疾病中发挥作用。但目前尚未有文献报道MSC移植对TBI后脑内细胞焦亡的影响。肿瘤坏死因子刺激基因/蛋白6（tumor necrosis factorαstimulatedgene/protein 6,TSG-6）,是一种强效的抗炎因子,在干细胞等许多细胞类型中表达,能在诸多疾病中发挥抗炎修复作用。而尚未有文献报道TSG-6对细胞焦亡的影响。第一章创伤性脑损伤脑皮层中小胶质细胞/巨噬细胞和细胞焦亡相关因子的时间变化研究目的探讨TBI后脑皮层中小胶质细胞/巨噬细胞和细胞焦亡相关因子的时间变化规律。方法为研究TBI小鼠脑内细胞焦亡发生的时间规律,在本实验研究中,我们使用控制皮层打击法制作TBI小鼠模型,在不同时间点采集脑皮层组织和血清样品。首先,采用乳酸脱氢酶（LDH,lactate dehydrogenase）活性试剂盒和半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）活性试剂盒来检测小鼠血清中的LDH活性及损伤脑皮层中的Caspase-1活性,并通过Western blotting方法检测损伤侧脑皮层中细胞焦亡通路Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor protein 3,NLRP3）/Caspase-1 p20/消皮素 D（GasderminD,GSDMD）的表达情况,初步分析TBI后小鼠脑内细胞焦亡的情况。然后,采用免疫组织荧光双染技术进一步确认NLRP3、Caspase-1 p20及GSDMD的表达情况,同时通过这些指标与小胶质细胞/巨噬细胞Iba-1的共定位来判断小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡情况。而细胞焦亡发生时,常伴随着大量细胞焦亡相关促炎因子的释放,故我们使用ELISA试剂盒检测了小鼠损伤脑皮层中IL-1β、IL-18及TNF-α的蛋白表达含量。结果血清LDH活性在TBI后12小时开始增加,24小时达到峰值,之后逐渐下降。损伤脑皮层中的Caspase-1活性在TBI后开始逐渐升高,24小时达到高峰,随后稳定表达。NLRP3+和GSDMD+细胞密度及蛋白表达均在TBI后开始就逐渐增加,48小时达到峰值,而Caspase-1 p20+细胞密度及蛋白表达在24小时就达到峰值,随后稳定表达。NLRP3+Iba-1+、Caspase-1 p20+Iba-1+及 GSDMD+Iba-1+细胞密度均在48小时达到峰值。IL-1β在TBI后开始逐渐升高,24小时及48小时到达高峰。IL-18在TBI后12小时达到高峰,随后缓慢下降。TNF-α在TBI后开始逐渐升高,24小时到达高峰,随后缓慢下降。结论小鼠TBI造模后,细胞焦亡相关因子虽然出现不同的变化规律,但是大部分峰值主要集中在24小时及48小时,而48小时是观察小胶质细胞/巨噬细胞Iba-1与细胞焦亡通路蛋白重合的最佳时间点。第二章TSG-6对hUMSC调控细胞焦亡修复脑损伤的作用及机制研究目的探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cell,hUMSC）是否通过分泌TSG-6影响脑内细胞焦亡,及其在修复脑损伤中的作用与机制。方法为研究TSG-6对hUMSC调控TBI小鼠脑内细胞焦亡的影响。首先,我们采用sh-TSG-6慢病毒转染hUMSC的方法,敲减hUMSC中TSG-6的表达。然后,使用控制皮层打击法制作TBI小鼠模型,并在造模后4小时通过侧脑室注射正常或敲减TSG-6的hUMSC或不同浓度rmTSG-6。为初步判断hUMSC和TSG-6的脑保护作用,我们使用mNSS评分系统评估脑损伤后12小时、24小时、48小时和72小时的神经运动功能情况,同时测量了 24小时及48小时的脑组织水含量,并通过Tunel染色技术来确定死亡细胞数目。为更进一步分析hUMSC和TSG-6对TBI后细胞焦亡的影响,本研究检测了 TBI后损伤脑皮层中Caspase-1的活性及小鼠血清中LDH的活性;同时,通过Western blotting检测脑皮层中细胞焦亡信号通路蛋白NLRP3、Caspase-1 p20及GSDMD的表达水平,并采用免疫荧光双染技术检测脑皮层中NLRP3、Caspase-1 p20及GSDMD分别与Iba-1的共定位来判断小胶质细胞/巨噬细胞的焦亡情况。此外,我们还通过ELISA试剂盒检测了损伤脑皮层中焦亡相关促炎因子IL-1β、IL-18及TNF-α的表达情况。结果sh-TSG-6慢病毒成功敲减了 hUMSC中TSG-6的表达。与TBI组对比,移植hUMSC或给予不同浓度rmTSG-6均可以明显改善TBI小鼠的神经运动功能、降低脑组织水含量、减少脑内细胞凋亡、抑制脑皮层内Caspase-1活性、减少小鼠血清中LDH释放以及减少损伤脑皮层中IL-1β、IL-18及TNF-α的含量。而与正常hUMSC组对比,移植敲减TSG-6的hUMSC对上述指标的作用显著减弱。组织免疫荧光分析和Western blotting表明,与TBI组对比,移植hUMSC或给予不同浓度rmTSG-6均可以明显抑制TBI小鼠脑内细胞焦亡通路蛋白NLRP3/Caspase-1 p20/GSDMD的表达,同时抑制小胶质细胞/巨噬细胞焦亡。而与正常hUMSC组对比,移植敲减TSG-6的hUMSC对抑制焦亡通路蛋白表达和小胶质细胞/巨噬细胞焦亡的作用明显减弱。结论hUMSC及rmTSG-6均可以抑制TBI小鼠脑内细胞焦亡从而修复脑损伤,而hUMSC是通过分泌TSG-6抑制了脑内小胶质细胞焦亡。第三章TSG-6对hUMSC调控BV2小胶质细胞焦亡的作用及机制研究目的体外实验进一步探讨TSG-6对hUMSC调控BV2小胶质细胞焦亡的作用及机制。方法为了研究TSG-6对hUMSC调控小鼠小胶质细胞BV2焦亡的作用机制,我们在体外采用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）+三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）诱导BV2小胶质细胞焦亡的模型。利用Transwell培养板来评估hUMSC或TSG-6对LPS+ATP诱导BV2细胞焦亡的作用。首先,5×105个BV2细胞接种于培养板下室。实验组用1μg/ml LPS刺激12 h后加入5mM ATP刺激1h,对照组不加LPS+ATP。在上室加入5×105个不同预处理的hUMSC或者不同浓度的rmTSG-6。实验分组如下:（1）单纯LPS+ATP组;（2）单纯hUMSC处理组（LPS+ATP+hUMSC组）;（3）敲减TSG-6的hUMSC处理组（LPS+ATP+sh-TSG-6 hUMSC组）;（4）转染空载慢病毒的hUMSC处理组（LPS+ATP+sh-NC hUMSC 组）;（5）50ng/ml rmTSG-6 组;（6）1 00ng/ml rmTSG-6组;（7）200ng/ml rmTSG-6 组。以上各条件处理12小时后,采用碘化丙啶（Prodium Iodide,PI）染色试剂盒检测BV2细胞焦亡的情况,并使用Caspase-1活性试剂盒和LDH活性试剂盒检测不同分组BV2细胞中Caspase-1的活性及上清液中LDH活性,以初步分析TSG-6对hUMSC调控BV2小胶质细胞焦亡的作用。更进一步,我们通过Western Blotting检测了各分组BV2细胞中焦亡信号通路蛋白NLRP3、Caspase-1及GSDMD的表达情况;此外,本实验还采用ELISA剂盒检测了细胞上清中细胞焦亡相关促炎因子IL-1β、IL-18及TNF-α的含量。结果与hUMSC进行共培养或加入不同浓度rmTSG-6培养的BV2小胶质细胞受LPS+ATP刺激后,PI阳性细胞数量明显减少,Caspase-1活性明显减低,LDH释放明显减少,上清中IL-1β、IL-18及TNF-α的含量明显减少。而与敲减TSG-6的hUMSC共培养对LPS+ATP诱导的BV2小胶质细胞中上述指标的作用明显减弱。Western blotting显示,与hUMSC共培养或加入不同浓度rmTSG-6均可以明显抑制BV2小胶质细胞焦亡通路蛋白NLRP3/Caspase-1 p20/GSDMD的表达,而与敲减TSG-6的hUMSC共培养对抑制焦亡通路蛋白表达的作用明显减弱。结论hUMSC通过分泌TSG-6调控NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路抑制BV2小胶质细胞焦亡。