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【背景】心肌梗死（Myocardial infarction,MI）的发病率和死亡率在国际范围内都居高不下。目前临床上主要的治疗手段为经皮冠状动脉介入术（Percutaneous coronary intervention,PCI）,这可以使心外膜冠状动脉的血流得到恢复,从而降低患者的死亡率。但仍有相当一部分的患者在恢复血流灌注之后,心肌损伤反而加重,即“心肌缺血-再灌注损伤（Myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）”。血管紧张素转化酶2（Angiotensin converting enzyme2,ACE2）是肾素血管紧张素系统（Renin angiotensin system,RAS）中的主要活性物质,可水解血管紧张素II（Angiotensin II,Ang II）产生血管紧张素（1-7）[Angiotensin（1-7）,Ang（1-7）],随后作用于Mas受体通过各种信号转导途径产生舒张血管、抗氧化应激、抗炎等作用。硫化氢（Hydrogen sulfide,H2S）在细胞保护、炎症、血管功能、神经系统、组织修复和愈合、细胞凋亡和细胞周期、线粒体功能和能量代谢等方面发挥着重要作用。本课题组前期研究证实,外源性H2S可以减轻内皮细胞H/R损伤,但是否通过调控ACE2来实现尚未见报道。因此,本实验的目的是进一步探究H2S对H/R内皮细胞的保护机制,为临床上预防和治疗MIRI提供新的思路。【目的】探讨硫化氢对内皮细胞缺氧-复氧损伤影响的机制及其与ACE2的相关性。【方法】（1）为了探究H2S减轻HUVECs缺氧-复氧损伤的机制,首先建立内皮细胞缺氧-复氧损伤模型,采用不同浓度Na HS处理细胞,并设置空白对照,随后使用CCK-8和LDH试剂盒分别检测细胞活力和细胞损伤程度,确定最佳Na HS处理浓度;其次采用Na HS和/或PPG处理细胞,随后使用NO试剂盒、ELISA试剂盒和DHE荧光探针试剂分别检测血管舒缩因子水平、炎症水平和活性氧水平。（2）为了探究缺氧-复氧是否影响HUVECs中ACE2的蛋白表达水平,将细胞随机分为空白对照组和缺氧-复氧组,采用ELISA试剂盒检测Ang II和Ang（1-7）的含量,Western blot检测ACE2的蛋白表达水平。（3）为了探究H2S对HUVECs中ACE2蛋白表达水平的影响,我们分别研究Na HS浓度对HUVECs中ACE2蛋白表达水平的影响、Na HS的处理时间对HUVECs中ACE2蛋白表达水平的影响,Na HS浓度对缺氧-复氧HUVECs中ACE2蛋白表达水平的影响以及H2S对缺氧-复氧HUVECs中ACE2蛋白表达水平的影响,采用ELISA试剂盒检测不同组细胞培养液上清中Ang II和Ang（1-7）的含量,Western blot检测不同组ACE2的蛋白表达水平。（4）为了探究ACE2在H2S减轻HUVECs缺氧-复氧损伤中的作用,我们采用Na HS和/或DIZE和/或MLN-4760处理细胞,随后使用NO试剂盒检测细胞培养液上清中NO的含量,ELISA试剂盒检测细胞培养液上清中ET-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、Ang II和Ang（1-7）的含量,DHE荧光探针试剂检测HUVECs中ROS的含量,Western blot检测HUVECs中ACE2的蛋白表达水平。【结果】（1）（1）CCK-8和LDH结果显示,与空白对照组比较,H/R组的细胞活力显著减弱（P＜0.01）,LDH活性显著上升（P＜0.01）;与H/R组比较,100μM组、200μM组和400μM组的细胞活力显著增强（P＜0.05）,LDH活性显著下降（P＜0.05）。（2）与H/R组比较,Na HS+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著增加（P＜0.05）,ET-1含量显著减少（P＜0.01）,ROS荧光强度显著减弱（P＜0.01）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量均显著减少（P＜0.05）;与之相反,PPG+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著减少（P＜0.05）,ET-1含量显著增加（P＜0.05）,ROS荧光强度显著增强（P＜0.01）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量均显著增加（P＜0.05）,而在PPG+H/R组的基础上重新加入Na HS又可以逆转这一系列现象。以上结果提示H2S可减轻内皮细胞H/R损伤,其保护作用与纠正血管舒缩因子的失衡,抑制氧化应激和炎症反应有关。（2）与Control组比较,H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著增加（P＜0.01）,但Ang（1-7）含量显著减少（P＜0.01）,同时ACE2的蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。结果提示H/R可减少内皮细胞中ACE2的蛋白表达,进而改变Ang II与Ang（1-7）的含量。（3）（1）在一定Na HS浓度范围内（200-400μM）,细胞培养液上清中Ang II含量显著减少（P＜0.01）,同时Ang（1-7）含量显著升高（P＜0.01）,且200μM组和400μM组中ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。（2）200μM Na HS的处理时间在一定范围内（6-12 h）,细胞培养液上清中Ang II的含量显著减少（P＜0.05）,同时Ang（1-7）的含量显著升高（P＜0.01）,且ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。（3）在一定Na HS浓度范围内（200–400μM）,缺氧-复氧HUVECs的细胞培养液上清中Ang II含量显著减少（P＜0.01）,同时Ang（1-7）含量显著升高（P＜0.01）,且200μM组ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。（4）与H/R组比较,Na HS+H/R组的细胞培养液中Ang II含量显著减少（P＜0.01）,Ang（1-7）含量显著增加（P＜0.01）,同时ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）;与之相反,PPG+H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著增加（P＜0.05）,Ang（1-7）含量显著减少（P＜0.01）,ACE2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,而在PPG+H/R组的基础上重新加入Na HS又可以逆转这一系列现象。结果说明H2S可影响不同状态下内皮细胞中ACE2的表达,进而改变Ang II与Ang（1-7）的含量。（4）（1）与H/R组比较,DIZE+H/R组和Na HS+H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著减少（P＜0.01）,Ang（1-7）含量显著增加（P＜0.01）,ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,而MLN-4760+H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著增加（P＜0.01）,Ang（1-7）含量显著减少（P＜0.01）,MLN-4760+H/R组的ACE2蛋白表达水平无明显变化。与Na HS+H/R组比较,Na HS+DIZE+H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著减少（P＜0.01）,Ang（1-7）含量显著增加（P＜0.01）,ACE2蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,而Na HS+MLN-4760+H/R组的细胞培养液上清中Ang II含量显著增加（P＜0.01）,Ang（1-7）含量显著减少（P＜0.01）,ACE2蛋白表达水平无明显变化。（2）与H/R组比较,DIZE+H/R组和Na HS+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著增加（P＜0.01）,ET-1含量显著减少（P＜0.01）,ROS荧光强度显著减弱（P＜0.05）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.05）,而MLN-4760+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著减少（P＜0.01）,ET-1含量显著增加（P＜0.05）,ROS荧光强度显著增强（P＜0.01）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著增加（P＜0.01）。与Na HS+H/R组比较,Na HS+DIZE+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著增加（P＜0.01）,ET-1含量显著减少（P＜0.01）,ROS荧光强度显著减弱（P＜0.05）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.05）,而Na HS+MLN-4760+H/R组的细胞培养液上清中NO含量显著增加（P＜0.01）,ET-1含量显著减少（P＜0.05）,ROS荧光强度显著减弱（P＜0.05）,IL-1β、IL-6和TNF-α含量显著减少（P＜0.05）。以上结果说明,H2S纠正血管舒缩因子的失衡、抗氧化应激和抗炎作用依赖于ACE2,并且H2S通过上调ACE2来减轻内皮细胞H/R损伤。【结论】1.H2S可减轻内皮细胞缺氧-复氧损伤,其保护作用与纠正血管舒缩因子的失衡,抑制氧化应激和炎症反应有关;2.H2S对内皮细胞缺氧-复氧损伤的抑制作用是通过上调ACE2的蛋白表达来实现的。