冠状病毒是具有包膜结构的单链正义RNA病毒,其感染可以造成人类和动物的呼吸道以及肠道系统疾病,长期以来并未引起人类重视。本世纪相继出现了重症急性呼吸综合征冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus,SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory Syndrome coronavirus,MERS-CoV）和重症急性呼吸综合征冠状病毒2（Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus,SARS-CoV-2）三种致命性的冠状病毒。2002年至2003年,SARS-CoV在中国开始传播并迅速蔓延至全球29个国家,感染人数超过8000人。2012年6月,MERS-CoV在阿拉伯半岛爆发,主要在中东地区蔓延,感染人数超过2000人。这两次疫情显示了新型冠状病毒（CoVs）的高传染性和高致病性。2019年12月又爆发了SARS-CoV-2,对全球的生活、经济造成了严重的影响。目前全球正在加紧新冠疫苗的研发,阻止疫情的扩散。中东呼吸综合征冠状病毒与重症急性呼吸综合征冠状病毒相比虽然在全球的传播范围不广,但致死率却高达34%。根据WHO官方报道,至今尚没有针对MERS-CoV的疫苗或者特异性治疗手段,只能进行支持性质治疗。冠状病毒刺突蛋白S是冠状病毒的一类结构蛋白,是现阶段冠状病毒疫苗研发的主要靶点。为了进一步提高冠状病毒疫苗的特异性,解析病毒特有蛋白质的结构至关重要。MERS-CoV基因组除了编码刺突蛋白S等结构蛋白外,还编码多个附属蛋白。有趣的是,与冠状病毒家族的其他成员相比,MERS-CoV的基因组在结构蛋白S基因和E基因之间增加了两个附属蛋白基因ORF4a和ORF4b。研究表明MERS-CoV附属蛋白ORF4a和ORF4b在病毒入侵宿主后可以作为干扰素拮抗剂,逃避宿主先天免疫反应,进而增强病毒复制能力。ORF4a被鉴定为dsRNA结合蛋白,而ORF4b具有2’,5’-磷酸二酯酶功能,这在结构和酶学上与小鼠肝炎病毒编码的NS2蛋白相似。遗憾的是,目前为止ORF4a和ORF4b的结构还尚未解析。本文工作致力于得到成分均一、可用于结晶的ORF4a和ORF4b蛋白质样品,并利用多种生化分析方法检测样品的体外生物活性;同时本文从结构生物学角度入手,尝试对ORF4a和ORF4b进行结构初探,为后期ORF4a和ORF4b的三维空间结构解析奠定理论基础,为针对MERS-CoV的特异性疫苗研制提供参考。全长ORF4a有109个氨基酸,在真核细胞和原核细胞表达系统内均以单体形式存在。体外生化实验进一步证实了ORF4a可以和dsRNA结合;同时使用微量热泳动和荧光偏振等方法对ORF4a与dsRNA的亲和力进行了定量分析。全长ORF4b有246个氨基酸,全长ORF4b及其不同截短体蛋白在原核细胞表达系统内均无法以均一的可溶状态存在,然而截短体ORF4b53-246与ORF4a在真核细胞Expi293F内共表达时,ORF4b53-246能够以单体形式存在,本文猜测ORF4a充当了分子伴侣的角色促进了ORF4b53-246的正确折叠或者两者之间存在相互作用进而稳定了蛋白质的空间构象,但是具体的机制尚未研究清楚。