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研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,是老年期痴呆最为常见的一种类型。阿尔茨海默病的确切病因尚未明确,流行病学、神经病理学及遗传学研究表明该疾病是由多种病因引起的,很多因素参与AD的发病过程,如Aβ异常沉积、氧化应激、胰岛素抵抗等。AD主要的神经病理学特征为老年斑（senile plaques,SP）形成、神经元缺失、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle,NTF）和胶质增生。老年斑的主要组分为β淀粉样蛋白（amyloid-β peptide,Aβ）,A β是由β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）相继被β-分泌酶和γ-分泌酶切割而形成。A β在脑内神经元的异常沉积与A β过度产生、降解减慢及A β通过血脑屏障时的清除减少等相关。β位点APP切割酶1（BACE1）和BACE2是两个主要的β-分泌酶,BACE1作为一种跨膜天门冬氨酸蛋白酶在各种组织中广泛表达,且BACE1在转录水平受到严格调控。抑制BACE1活性可以减少体内Aβ的生成,因此BACE1抑制剂成为热门的药物研究靶点。然而,包括默沙东、礼来等多家药物公司在内的多款BACE1抑制剂药物在Ⅱ期或Ⅲ期临床试验中均以失败告终,这说明BACE1的正常生理功能远比我们目前所认知的复杂,之前的研究多数都将重点放在BACE1对A β生成的作用上,而忽略了对BACE1其他功能的探究,因而无法避免在AD治疗中抑制BACE1活性而产生的副作用。大量近期的研究表明在BACE1敲除小鼠中存在髓鞘生成异常、突触异常及行为学表现异常等,提示该酶在神经系统发育过程中发挥着重要功能。Kv2.1作为一种电压依赖性钾通道,广泛表达于脑组织,是构成海马和皮层锥体神经元延迟整流钾电流的主要组分,可有效抑制反复高频刺激下神经元的兴奋性。Kv2.1由六个跨膜区及胞内N-末端和C-末端组成。跨膜部分的S1-S6区形成四聚体,构成电压感应部位（S1-S4）和钾离子选择性孔道（S5-S6）。其中,在S5及S6之间的第377-381个氨基酸构成了 Kv2.1的选择性过滤器（selectivity filter）,该结构决定了 Kv2.1只允许钾离子通过的专一性。Kv2.1的N-端包含T1四聚体结构域（T1 tetramerization domain）,该结构域之间的相互作用可使四个Kv2.1分子形成功能性的四聚体。在神经元中,Kv2.1以高密度簇团样的结构分布在胞体以及近端树突上,通过磷酸化与去磷酸化动态调节Kv2.1的分布和功能可显著影响神经元兴奋性。在神经元中利用RNAi技术干扰Kv2.1的表达或采用Kv2.1的竞争性抑制突变体抑制Kv2.1的活性时,可有效降低钾离子电流并减少神经元的凋亡。研究目的本研究旨在证明Kv2.1是BACE1的新底物,并进一步明确BACE1对Kv2.1的切割位点及BACE1切割Kv2.1而引起的通道电生理学特性的改变,研究此切割作用对神经元凋亡的影响,从而探讨BACE1抑制剂药物在临床试验中失败的原因及BACE1能否通过切割Kv2.1通道而发挥神经保护作用。材料方法（1）Kv2.1 质粒（p3 × Flag-CMV10-Kv2.1）与 BACE1 过表达质粒（pEGFP-N2-BACE1）或其对照质粒（pEGFP-N2）共转染于HEK293细胞中,免疫荧光染色后,采用激光共聚焦显微镜观察BACE1对Kv2.1膜表达量的影响;（2）在小鼠腹腔注射BACE1抑制剂（LY2811376）,通过蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中Kv2.1蛋白水平的变化;（3）构建可以表达不同Kv2.1截短体的质粒;（4）将Kv2.1截短体质粒及其对照质粒与BACE1过表达或敲除质粒分别共转染于HEK293细胞,通过蛋白质印迹法检测各截短体蛋白的表达水平,并借助FRET技术分析切割位点;（5）应用细胞膜片钳技术研究BACE1切割Kv2.1对原代皮层神经元电生理功能的影响;（6）原位末端转移酶标记法检测BACE1切割Kv2.1对神经元凋亡的影响;通过对原代皮层神经元ATP水平和caspase 3/7活性的测定,明确BACE1慢病毒及BACE1抑制剂对神经元活性的影响。实验结果（1）免疫荧光染色结果显示,过表达BACE1可降低Kv2.1在细胞膜表面的荧光强度;（2）在小鼠体内注射BACE1抑制剂后,小鼠大脑中Kv2.1蛋白水平显著升高,且升高程度呈时间依赖性;（3）过表达BACE1能下调Kv2.1的蛋白水平,敲除内源性BACE1能上调Kv2.1蛋白的表达量;（4）Western blotting及FRET证实BACE1对Kv2.1有三个切割位点,分别位于其氨基酸序列的K489-E508,Q540-N546和V705-A711;（5）全细胞膜片钳证明BACE1切割Kv2.1导致钾通道电流密度降低;（6）TUNEL染色证明BACE1切割Kv2.1能降低神经元的凋亡率;ATP水平和caspase 3/7活性的变化表明BACE1慢病毒能提高神经元的活性,BACE1抑制剂促进神经元凋亡。实验结论Kv2.1是BACE1新的作用底物,BACE1对Kv2.1有三个氨基酸切割位点,分别位于 K489-E508,Q540-N546 和 V705-A711;BACE1 切割 Kv2.1 降低通道的Ik;BACE1对Kv2.1的切割作用能减少神经元凋亡。本课题证实BACE1切割Kv2.1并发挥神经保护作用,从分子机制上解释了 BACE1抑制剂药物在临床试验中失败的可能原因。