研究背景动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）作为冠状动脉疾病（Coronary artery disease,CAD）最常见的潜在病因,是目前导致全球人口死亡的主要原因。AS斑块易损、破裂和血栓形成是导致急性心脑血管事件的主要病理机制。易损斑块的早期积极干预,对于预防和减低急性心脑血管事件的发生具有重要意义。研究发现,斑块内新生血管增多是斑块内炎症的先决或并发因素,斑块内巨噬细胞浸润、斑块内出血和薄帽纤维粥瘤的形成都与新生滋养血管的密度密切相关,这种现象存在于心血管病患者整个动脉床中。在AS发生发展过程中,由于内膜缺氧,起源于外膜的血管外膜滋养管（Adventitial vasa vasorum,VV）增生以增加血管壁供氧,进而造成斑块内出血。传统观点认为AS起源于内膜损伤,内膜炎症扩展到外膜及血管周围脂肪组织（Perivascularadiposetissue,PVAT）,PVAT的炎症状态可作为AS的标志。然而越来越多的证据表明PVAT以一种“由外而内”的方式促进血管疾病,管周脂肪细胞来源的脂肪因子可影响并促进血管外膜及内膜的炎症状态和细胞增殖。血管外膜及内膜之间存在复杂的相互作用关系。有证据表明,VV增生早于内膜增厚甚至早于血管内皮功能障碍的发生,而PVAT功能障碍与VV增生相关,增生的VV作为炎性细胞和炎症因子在PVAT与血管内膜的运输管道,增加了两者之间的相互作用,影响AS的发生发展。作为最强的天然抗血管新生因子,色素上皮衍生因子（Pigment epithelium-derived factor,PEDF）是Tombran-Tink等1989年首先从胎儿视网膜色素上皮细胞的培养液中提取的,其抑制血管生成的作用是内皮抑制素的7倍,且PEDF的抗血管生成作用只针对新生的异常血管,对已经形成的正常血管无损伤作用。PEDF是一种多功能蛋白,除了具备很强的抑制血管新生作用之外,还具有抗炎、抗氧化、抑制血栓形成等作用,因此在稳定斑块的作用中,除了强效的抗血管新生作用之外的多效性,使PEDF具备了更多的优势。目前已知的PEDF特异性受体包括脂肪甘油三酯脂酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）/独立磷脂酶 A2（independentphospholipase A2,iPLA2）及 37/67-kDa层粘连蛋白受体（Laminin receptor,LR）。LR最初被鉴定为层黏连蛋白的67-kDa结合蛋白,在生命领域广泛存在,具有多种生理作用。越来越多的证据表明,LR在细胞信号转导中起到中介分子的作用。研究证实,PEDF及其衍生物与细胞膜的LR结构域结合,发挥其抗血管新生作用,抑制LR后可减弱PEDF的作用。但PEDF与LR结合后对血管内皮细胞信号通路的作用尚无深入研究。根据目前研究,我们认为上调PVAT来源的PEDF是抑制血管外膜VV新生和稳定斑块的重要手段,然而目前尚未发现PEDF的有效激动剂。多项研究结果表明,经典中药人参的主要活性物质人参皂苷Rb1可抑制AS的发生发展。课题组前期实验证实,Rb1 能够抑制人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）的增殖、迁移及小管形成,并证明Rbl通过调节PEDF表达发挥抑制血管新生作用。但Rb1的抗动脉粥样硬化作用是否与PEDF及抑制血管新生相关,目前尚无定论。虽然多项研究结果表明PEDF很可能是抑制VV新生、稳定斑块的有效因子,但是目前并没有直接证据。同时PEDF抑制血管新生的分子机制尚待进一步的研究。因此,本研究通过干预ApoE-/-小鼠体内PEDF的表达探究PEDF在动脉粥样硬化中的作用,探索其具体机制,为抗动脉粥样硬化治疗靶点提供新的方向和证据。论文Ⅰ 管周脂肪PEDF通过抑制血管外膜滋养管生成抗动脉粥样硬化的机制研究研究目的1.探讨心包脂肪PEDF在AS进展中的表达变化;2.探讨全身敲减PEDF对AS的影响;3.探讨干预管周脂肪PEDF对血管外膜滋养管的影响,分析PEDF影响AS的机制;4.探讨PEDF抑制血管新生的分子机制。研究方法1.冠心病患者体内PEDF含量检测Western blot及RT-qPCR检测冠心病及非冠心病患者中心包脂肪组织中PEDF的mRNA及蛋白表达水平;ELISA检测两组患者血清中PEDF的含量。本实验已获得山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准。2.构建PEDF敲减的AS斑块动物模型8周龄ApoE-/-雄鼠尾静脉注射PEDF干扰慢病毒（PEDF shRNA）或空载体病毒（CTR shRNA）,并给予高脂高胆固醇饮食（40%脂肪,1.25%胆固醇）喂养12 w,构建PEDF敲减的斑块模型。ELISA检测小鼠血清中PEDF的含量,免疫组化检测斑块内PEDF表达水平,明确PEDF敲减成功。3.构建管周脂肪移植的斑块模型在PEDF敲减的ApoE-/-小鼠的基础上构建颈动脉管周脂肪移植模型。8周龄ApoE-/-雄鼠随机分为非手术组及手术组。非手术组小鼠分为空载体组（CTR shRNA组,n=15）和PEDF敲减组（PEDF shRNA组,n=15）。手术组小鼠分为提供内脏脂肪的供体组和接受脂肪移植的受体组。根据提供的内脏脂肪中PEDF是否敲减,供体组小鼠分为空载体组（Donor-CTR shRNA 组,D-CTR shRNA 组,n=15）和 PEDF 敲减组（Donor-PEDF shRNA组,D-PEDF shRNA组,n=15）;为排除循环水平PEDF对移植脂肪的颈动脉AS的影响,受体组小鼠均为PEDF敲减的小鼠（PEDF shRNA）。移植供体小鼠的10 mg内脏脂肪（Visceral adipose tissue,VAT）至受体小鼠左侧颈动脉。为研究PVAT中PEDF对局部血管AS的影响,移植术后2 w,在超声引导下向移植的脂肪中注射PEDF过表达腺相关病毒（Adeno-associated virus-PEDF,AAV-PEDF）或腺相关病毒空载体（AAV-CTR）。根据移植脂肪组织PEDF是否敲减,以及移植后脂肪组织PEDF是否过表达,手术组小鼠分为 D-CTR shRNA+AAV-CTR 组、D-CTR shRNA+AAV-PEDF 组、D-PEDF shRNA+AAV-CTR组和D-PEDF shRNA+AAV-PEDF 组（n=15/组）。4.探讨PEDF敲减对炎症因子的影响ELISA检测CTR shRNA组及PEDF shRNA组小鼠血清炎症因子肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-α,TNFα）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）、白介素 1β（Interleukin-1β,IL-1β）。免疫组化验证斑块中炎症因子的含量。5.探讨PEDF敲减对血脂的影响生化检测仪检测CTR shRNA组及PEDF shRNA组小鼠血清中总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triacylglycerol,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C）及高密度脂蛋白胆固醇（High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）含量。6.探讨PEDF敲减对斑块稳定性的影响（1）HE染色:HE染色观察主动脉根部及颈动脉移植脂肪部位斑块的形态、结构成分和面积;（2）油红O染色:观察斑块内脂质成分及比例;（3）天狼星红染色:观察斑块内胶原成分及比例;（4）免疫荧光:对冰冻切片进行免疫荧光染色,检测斑块内的巨噬细胞（MOMA2）、平滑肌细胞（αSMA）;（5）免疫组化:检测斑块及移植脂肪中的PEDF、TNFα、IL-6、IL-1β的表达及VV（Endomucin）密度。7.在ApoE-/-/PEDF-/-小鼠体内验证PEDF对动脉粥样硬化的影响（1）AS模型构建:ApoE-/-/PEDF-/-双敲小鼠由中山大学蔡卫斌教授捐赠。8周龄的ApoE-/-/PEDF-/-雄鼠,高脂高胆固醇喂养12 w。Western blot及免疫组化验证VAT及斑块内PEDF表达水平,验证PEDF敲除成功。（2）PEDF对炎症的影响:Western blot及免疫组化检测各组小鼠VAT中的炎症因子含量。（3）PEDF对血脂的影响:生化法检测各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。（4）PEDF对斑块稳定性的影响:1)HE染色:HE染色观察斑块的形态、结构成分和面积;2)油红O染色:观察斑块内脂质成分及比例;3)天狼星红染色:观察斑块内胶原成分及比例;4)免疫荧光:对冰冻切片进行免疫荧光染色,检测斑块内的巨噬细胞（MOMA2）、平滑肌细胞（αSMA）。8.明确PEDF对小鼠主动脉内皮细胞（Mouse aortic endothelial cells,MAECs）的最佳作用时间PEDF重组蛋白（100ng/ml）作用于MAECs,作用时间分别为0、4、8、12、16、20及24 h,确定最佳作用时间,进行后续实验。9.MAECs血管新生功能检测为研究PEDF对MAECs血管新生的影响,向MAECs加入PEDF（100 ng/ml）及等量PBS（Vehicle）。为研究LR在PEDF抗血管新生中的作用,向MAECs转染LR siRNA及对照siRNA（CTR siRNA）。为研究自噬在PEDF抗血管新生中的作用,向MAECs 中转染 Atg5 siRNA及 CTR siRNA。细胞分为以下 4 组:①CTR siRNA+Vehicle组;②CTR siRNA+PEDF 组;③LR siRNA+PEDF 组;④Atg5 siRNA+PEDF 组。Western blot检测各组MAECs中VEGFA及VEGFR2的表达。5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）法检测MAECs增殖水平;划痕实验及Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移功能;Matrigel基质胶检测MAECs的成管功能。10.MAECs自噬流检测Western blot 检测各组 MAECs 中 LC3、Atg5、SQSTM1/p62、Beclin1 等自噬相关蛋白的表达水平。向各组MAECs转染mRFP-GFP-LC3双荧光标记腺病毒。正置荧光显微镜下观察自噬体及自噬溶酶体形成情况。11.探究脂肪细胞PEDF对MAECs细胞迁移的影响为模拟体内PVAT与血管内皮的解剖学位置关系,体外共培养成熟脂肪细胞与MAECs,下室为成熟脂肪细胞,上室为MAECs。为研究脂肪细胞PEDF对MAECs的作用,向成熟的脂肪细胞中转染PEDF siRNA及CTR siRNA。ELISA检测各组细胞上清中PEDF含量;Transwell检测MAECs的细胞迁移。12.统计学分析定量数据表示为均数±标准误（Mean±SEM）。对所有数据进行正态分布性检验。两组数据间的比较应用独立样本t检验,三组及以上的数据比较应用单因素方差分析。P＜0.05被认为有统计学差异。研究结果1.冠心病患者血清及心包脂肪中PEDF含量降低冠心病患者心包脂肪组织及血清中PEDF含量较非冠心病患者降低。2.PEDF敲减的ApoE-/-小鼠模型构建成功PEDF shRNA组小鼠斑块及VAT中PEDF表达显著降低。ELISA结果证实PEDF敲减小鼠血清PEDF含量较对照组明显减少。3.PEDF敲减增加炎症水平ELISA结果显示,PEDF敲减的小鼠血清中IL-6及IL-1β含量增加,TNFα含量无明显差异。4.PEDF敲减对血脂无显著影响生化检测结果显示,CTR shRNA组及PEDF shRNA组小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C含量无显著差异。5.PEDF敲减加速AS进展主动脉大体油红O染色结果显示,PEDF敲减小鼠主动脉斑块面积增大。主动脉根部冰冻切片染色结果显示PEDF敲减小鼠斑块面积增大,且斑块内脂质沉积增加、巨噬细胞比例明显增加、平滑肌细胞减少、胶原成分减少,即PEDF敲减增加斑块易损性。同时PEDF敲减小鼠主动脉根部斑块内TNFα、IL-6、IL-1β等炎症因子表达较对照组增加。6.管周脂肪移植加速颈动脉AS进展,管周脂肪组织来源的PEDF改善颈动脉局部斑块负荷大体油红O染色结果显示,与非手术组小鼠相比,手术组小鼠左侧颈总动脉斑块面积显著增加。连续冰冻切片染色结果显示,管周脂肪过表达PEDF组小鼠颈动脉斑块面积较非过表达PEDF组小鼠降低,同时斑块内巨噬细胞及脂质减少、平滑肌细胞及胶原纤维成分增加,斑块稳定性增加。术后4 w颈动脉超声结果显示,D-CTR shRNA+AAV-PEDF组小鼠颈动脉脉搏波传导速度（Pulse wave velocity,PWV）较D-CTR shRNA+AAV-CTR 组降低。7.管周脂肪组织来源的PEDF改善颈动脉局部斑块炎症水平颈动脉及移植PVAT的冰冻切片免疫组化染色结果显示,PVAT过表达PEDF组小鼠颈动脉斑块TNFα和IL-6表达水平较非过表达PEDF组降低。8.管周脂肪来源的PEDF抑制VV新生颈动脉及移植PVAT的冰冻切片免疫组化染色结果显示,PVAT过表达PEDF组小鼠颈动脉斑块处血管外膜VV密度较非过表达PEDF组减少。9.PEDF敲除加速AS进展主动脉大体油红O染色结果显示,PEDF敲除的ApoE-/-小鼠主动脉斑块面积增加。与ApoE-/-小鼠相比,PEDF敲除的小鼠斑块内巨噬细胞比例明显增加、平滑肌细胞减少、胶原纤维含量减少,即PEDF敲除增加斑块易损性。10.PEDF敲除增加炎症水平PEDF敲除小鼠VAT中IL-6及TNFα表达显著增加,IL-1β蛋白表达有增加趋势。11.PEDF敲除增加血脂水平PEDF敲除小鼠血清TC、TG及LDL-C水平显著增加,HDL-C水平有降低趋势。12.PEDF抑制MAECs的血管新生能力PEDF抑制MAECs中VEGFA蛋白表达,同时降低VEGFA/VEGFR2比例,该作用具有时间依赖性。PEDF可显著抑制MAECs的增殖、迁移及小管形成。13.PEDF通过LR抑制MAECs的血管新生与 CTR siRNA+PEDF 组相比,LR siRNA+PEDF 组 MAECs 中 VEGFA 蛋白含量明显增加、VEGFR2蛋白表达明显减少,VEGFA/VEGFR2比例有增加的趋势;同时抑制LR表达可减轻PEDF对MAECs增殖、迁移和小管形成的抑制作用。免疫共沉淀证实,LR可与RACK1结合。干预MAECs中的RACK1可抑制PEDF的抗血管新生作用。14.PEDF通过作用于LR促进自噬进而抑制MAECs的血管新生能力PEDF增加MAECs中的LCⅡ蛋白表达、降低SQSTM1/p62蛋白表达,且该作用具有时间依赖性。PEDF增加MAECs自噬溶酶体的形成。干扰Atg5的表达,抑制PEDF对MAECs自噬的促进作用,MAECs中LC3 Ⅱ及Beclin1蛋白表达降低,SQSTM1/p62蛋白表达增加,自噬溶酶体数量降低。与CTR siRNA+PEDF组相比,Atg5 siRNA+PEDF组MAECs中VEGFA蛋白含量明显增加、EdU阳性细胞明显增加、迁移细胞数明显增加、划痕愈合面积增加、小管形成数目增加。干预LR后,PEDF对MAECs自噬的促进作用被抑制。15.脂肪细胞PEDF可抑制MAECs的迁移脂肪细胞与MAECs共培养体系中,PEDF siRNA组上清PEDF含量较CTR siRNA组显著降低;Transwell迁移实验结果证实,干扰脂肪细胞中PEDF的分泌可促进MAECs的迁移。研究结论1.冠心病患者心包脂肪及血清中PEDF含量较非冠心病患者降低;2.PEDF敲减增加斑块内炎症水平,降低斑块稳定性,加速动脉动脉粥样硬化的发展;3.管周脂肪组织来源的PEDF,抑制血管外膜滋养管新生,降低局部血管的斑块内炎症水平,增加斑块稳定性,抑制动脉粥样硬化的发展;4.PEDF通过作用于LR和RACK1,促进内皮细胞自噬,进而抑制内皮细胞的血管新生。论文Ⅱ 人参皂苷Rb1通过调节miR-33与PEDF抑制外膜滋养管新生并稳定斑块研究目的1.验证PEDF是mi-R33的靶基因;2.验证Rbl对动脉粥样硬化发生发展的作用;3.探讨Rb1对血管外膜滋养管新生的作用;4.验证Rb1调控血管外膜滋养管的分子机制。研究方法1.验证PEDF是miR-33的靶基因灵长类动物表达两种类型的miR-33,即miR-33a和miR-33b;而啮齿类动物仅表达一种类型的miR-33,即miR-33a。为验证PEDF是miR-33的靶基因,将PEDF的3’-UTR构建入带有荧光素酶的表达载体（pLightSwitch-3’-UTR vector）,构建荧光素酶质粒（WT）;同时对预测的结合位点进行突变,构建突变型质粒（MUT）。将构建的野生型和突变型质粒分别与miR-33a的类似物（mimic）及类似物的对照物（CTR）转染至HUVECs中,同时将带有海肾荧光素酶基因的质粒（phRL-TK）作为对照质粒与报告基因质粒共同转染至细胞。细胞分为4组:①WT+CTR;②WT+mimic;③MUT+CTR;④MUT+mimic。裂解细胞,并加入底物荧光素,检测不同组别细胞的荧光素酶活性。2.小鼠动脉粥样硬化斑块模型构建45只8周龄的ApoE-/-小鼠高脂喂养（0.25%胆固醇、15%可可脂）20 w。3.探讨Rb1对PEDF表达及动脉粥样硬化斑块稳定性的影响（1）HE染色:HE染色观察主动脉根部斑块的形态、结构成分和面积。（2）油红O染色:观察斑块内脂质成分及比例。（3）天狼星红染色:观察斑块内胶原成分及比例。（4）免疫组化:检测斑块中的PEDF、TNFα、IL-6、IL-1β、MOMA2及αSMA的表达。4.验证Rb1通过调节miR-33增加PEDF表达并抑制血管外膜滋养管新生将 ApoE-/-小鼠随机分为 3 组（n=15 只/组）,即 Vehicle+LV-vector 组,Rb1+LV-vector组,Rb1+LV-miR-33组。Rb1+LV-miR-33组小鼠尾静脉注射过表达miR-33的慢病毒,同时连续腹腔注射Rb1（50mg/kg/d）4 w;Rb1+LV-vector组小鼠尾静脉注射等量空载体慢病毒并连续腹腔注射Rb1;Vehicle+LV-vector组小鼠给予等量的生理盐水及空载体慢病毒。RT-qPCR验证各组斑块处miR-33表达水平。小鼠取材前通过体内灌注生物素标记的番茄凝集素标记血管外膜滋养管,评估各组小鼠VV密度。免疫组化染色检测各组小鼠斑块中PEDF的表达水平。5.探讨Rb1对血脂的影响生化检测仪检测各组小鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C含量。6.统计学分析定量数据表示为均数±标准误（Mean±SEM）。对所有数据进行正态分布性检验。两组数据间的比较应用独立样本t检验,三组及以上的数据比较应用单因素方差分析。P＜0.05被认为有统计学差异。研究结果1.PEDF是miR-33的靶基因转染野生型质粒的细胞中,过表达miR-33a可显著抑制荧光素酶的活性;将PEDF 3’-UTR的结合位点突变后,过表达miR-33a对细胞中的荧光素酶活性无影响。证实,PEDF是miR-33的靶基因。2.Rb1抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发展、增加斑块稳定性Rbl+LV-vector组小鼠斑块负荷较Vehicle+LV-vector组明显减小,同时斑块内平滑肌细胞增加、胶原纤维成分增加、巨噬细胞减少、脂质沉积减少,即Rbl增加斑块稳定性。同时,Rbl+LV-vector组小鼠斑块内炎症因子IL-1β、IL-6及TNFα等的含量较Vehicle+LV-vector组显著降低。3.Rb1抑制ApoE-/-小鼠斑块处血管外膜滋养管增生番茄凝集素染色结果显示,Rb1+LV-vector组小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块周围血管外膜滋养管密度较Vehicle+LV-vector组减少,提示Rbl可抑制斑块处血管外膜滋养管增生。4.miR-33过表达抑制Rb1对斑块的改善作用与Rbl+LV-vector组小鼠相比,Rb1+LV-miR-33组小鼠斑块内巨噬细胞及脂质含量增加、平滑肌细胞及胶原纤维含量减少,斑块易损性增加。Rbl+LV-miR-33组小鼠斑块内炎症因子含量较Rbl+LV-vector组显著增加。同时,过表达miR-33可显著减弱Rb1对血管外膜滋养管的抑制作用。5.miR-33参与Rb1对PEDF的促进作用与Vehicle+ LV-vector组相比,Rbl+LV-vector组小鼠斑块内PEDF含量显著增加。同时,过表达miR-33可显著抑制Rb1对PEDF表达的促进作用。6.Rb1对血脂无影响Vehicle+LV-vector 组、Rb1+LV-vector 组和 Rb1+LV-miR-33 组小鼠血清中 TC、TG、LDL-C及HDL-C含量无统计学差异,Rb1对血脂无显著影响。研究结论1.PEDF是miR-33的靶基因;2.Rbl通过抑制血管外膜滋养管新生及斑块内炎症,增加斑块稳定性;3.Rbl通过调控miR-33及PEDF表达,抑制血管外膜滋养管新生及斑块内炎症反应。