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目的结合网络药理学预测和细胞实验,探讨在缺氧微环境下,HIF-1α对HSC-T6增殖的影响及中药慈菇消脂方的干预机制。方法1.网络药理学通过TCMSP、ETCM及BATMAN-TCM数据库检索慈菇消脂方中药物含有的化学成分;运用Uni Prot数据库查询成分靶点对应的基因;通过Gene Cards及Pharm GKB数据库检索肝纤维化的靶点;借助Omic Share平台获得慈菇消脂方治疗肝纤维化的潜在作用靶点;使用STRING数据库进行蛋白-蛋白互作分析;利用Cytoscape3.7.2软件构建药物-成分-靶点网络;通过Omic Share平台进行GO富集分析和KEGG信号通路分析。2.细胞实验2.1中药汤剂煎煮、浓缩后制备慈菇消脂方药液,20只雌雄各半的SD大鼠,随机分为两组,空白组和中药组,分别灌胃后进行含药血清提取和配制。2.2体外培养HSC-T6细胞,采用CoCl2化学诱导缺氧法干预HSC-T6细胞,制备缺氧模型。2.3不同浓度（0、100、200、400、600、800μM）CoCl2作用24h和48h,采用CCK-8法来测定细胞活力,选择100μM CoCl2作用24h制备缺氧模型。2.4体外培养HSC-T6细胞,细胞划痕实验检测分别给予不同干预后,缺氧诱导下肝星状细胞运动与迁移能力的变化。2.5体外培养HSC-T6细胞,实验随机分为空白对照组、缺氧组、缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组,Western Blot和RT-PCR检测在经过不同处理后,HSC-T6细胞活化蛋白α-SMA和Collagen I的表达,Hh信号通路相关蛋白Gli-1、Ptch、Shh的表达,以及HIF-1α的表达。结果1.慈菇消脂方包含活性成分279个、成分靶点275个及关键靶点42个;GO功能富集分析获得4848个条目,KEGG通路富集分析筛选得到20条信号通路。分析药物-成分-靶点网络,显示槲皮素、山奈酚、柚皮素、木犀草素、豆甾醇、汉黄芩素等活性成分在整个网络中发挥着关键作用。通过网络拓扑分析发现HIF-1α是慈菇消脂方治疗肝纤维化的关键靶点。HIF-1α可刺激纤维化基因与炎症基因表达,启动脂肪组织纤维化进程。2.CCK-8检测不同浓度CoCl2对细胞活性影响:使用不同浓度的CoCl2处理HSC-T6细胞24h、48h,采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,结果表明,HSC-T6细胞活性随着CoCl2浓度的增加和作用时间的延长而逐渐降低。选择100μM CoCl2作为HSC-T6细胞造模浓度处理24h,来进行后续的各项实验,可以最大限度诱导HSC-T6细胞发生细胞活化的同时且并不会出现影响细胞活性的情况。3.各组HSC-T6细胞划痕检测细胞愈合百分比:用划痕实验检测空白对照组、缺氧组、缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组,在相应处理后观察各组细胞的迁移情况,结果显示:与空白对照组相比,缺氧组、缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组在相应处理后划痕治愈力明显增加,与缺氧组相比,缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组在相应处理后划痕治愈力降低,与缺氧+含药血清组相比,缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组划痕治愈力明显增加。4.各组HSC-T6细胞内HIF-1α、α-SMA、Ptch-1、Gli-1蛋白表达水平Western blot的结果表明,与空白对照组相比,缺氧组中的HIF-1α、α-SMA、Ptch-1、Gli-1蛋白表达上调;与缺氧组相比,缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组HIF-1α、α-SMA、Ptch-1、Gli-1蛋白表达均出现下调;与缺氧+含药血清组相比,缺氧+YC-1组Ptch-1蛋白表达上调。5.各组HSC-T6细胞内HIF-1α、α-SMA、Ptch-1、Shh、Collagen I m RNA表达水平RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,缺氧组HIF-1α、α-SMA、Ptch-1、Shh、Collagen I m RNA表达上调。与缺氧组相比,除缺氧+含药血清组HIF-1αm RNA、缺氧+YC-1组Shh m RNA表达无明显差异以外;与缺氧组相比,缺氧+YC-1组、缺氧+环巴胺组、缺氧+含药血清组HIF-1αm RNA、Shh m RNA、Ptch-1 m RNA、α-SMA m RNA、Collagen I m RNA表达明显下调。与缺氧+含药血清组相比,缺氧+YC-1组HIF-1αm RNA表达下调,Ptch-1 m RNA表达上调;缺氧+环巴胺组HIF-1α、Collagen I m RNA表达下调。结论1.缺氧状态下,HIF-1α表达上调,HSC-T6细胞活性增加,Hh信号通路相关蛋白表达上调,说明其参与HSC-T6活化。2.HIF-1α抑制剂可下调Ptch-1和Gli-1表达,说明HIF-1α是通过激活Hh信号通路而促进HSC-T6活化,进而增加胶原生成,促进纤维化。3.慈菇消脂方含药血清可通过下调HIF-1α表达进而抑制Hh信号通路发挥降低HSC-T6活性,减少胶原生成,从而治疗肝纤维化的作用。