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研究背景:偏头痛是一种临床上十分常见的原发性神经系统性疾病,单侧中重度搏动样头痛是最主要的症状,有时会双侧交替发作甚至严重者累及双侧,往往会伴随畏光、畏声、恶心、呕吐等症状。具有病程长、易反复、缠绵难愈的特点。偏头痛目前发病机制尚不十明确,主流学说认为偏头痛与三叉神经血管学说、皮层扩散性抑制、基因因素以及生化因素等密切相关。在中医古代文献里,偏头痛又有“首风”、“脑风”等名称,祖国医学将“风邪”列为导致偏头痛发生的重要病因。《黄帝内经》中有“新沐中风,则为首风”的论述,认为体虚之人调适不当又有风邪外袭是导致偏头痛的重要病因,典型诱发的情况是沐浴后头部未干,腠理开泄之时,风热侵袭而发为头痛。根据本课题组前期大量的文献统计以及临床经验观察,并以祛风清热之方剂反证以确定证候属性,推断风热证型是偏头痛的主要临床证型。病证结合动物模型采用西医病理造模因素叠加中医证候造模因素联合造模,能使证候在疾病的状态下放大,是目前非常常用的中医证候造模模型。目前尚无符合中医理论的风热证动物模型,故在病证结合动物模型的基础上,模拟中医病因因素造风热证模型加硝酸甘油（Niter acid Gansu oil,NTG）诱导大鼠偏头痛样症状,联合造风热证偏头痛模型,具有一定的研究价值和意义。葛根素和天麻素分别是中药葛根和天麻最主要的活性成分,临床上二者单独使用常被用于眩晕、高血压、椎基底动脉供血不足、突发性耳聋等疾病。但葛根素和天麻素在临床上的应用主要以注射液多见,葛根素注射液还有造成溶血等不良反应的风险。目前市面上均已研发出葛根素和天麻素的口服制剂,安全性高于注射液,提高葛根素和天麻素口服生物利用度成为研究的热点。药代动力学表明,二者联合使用能有效增加各自的吸收率,并且减少清除率,延长平均滞留时间。探究葛根素片和天麻素片联合应用治疗偏头痛的疗效,有助于为临床提供新的思路。研究目的:本研究根据病证结合模型,以“新沐中风则为首风”为偏头痛证候理论基础,以经典的硝酸甘油颈背部注射诱导偏头痛样表现模拟西医病理因素,采用游泳吹热风加颈背部注射硝酸甘油尝试制造风热证偏头痛模型,探究该病证结合模型的证候特点。治疗将葛根素片与天麻素片联合应用,观察联合应用的效果对风热证偏头痛模型大鼠痛阈的影响,探讨联合用药是否更能抑制偏头痛发作期间的痛觉敏化。并以大鼠脑内降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）及其受体活性修饰蛋白受体 1（receptor-associated membrane proteins 1,RAMP1）和降钙素受体样受体（calcitonin receptorlike receptor,CRLR）的表达情况为指标,衡量联合应用的治疗效果,为临床治疗偏头痛提供更多的思路。研究方法:实验用SPF级雄性SD大鼠60只,每只体重180-220g,随机分为空白对照组、风热证偏头痛模型组、葛根素片联合天麻素片组、天麻素片组、葛根素片组、舒马普坦组,每组10只。（1）空白对照组:实验第一天和第二天正常喂养,不作任何处理,实验第四天开始予以10ml/kg/d生理盐水灌胃,连续三天;（2）风热证偏头痛模型组:实验第1,2,3天先游泳,水温（24~26℃）,时间30min,游泳后在恒温箱吹热风,温度（39±0.5℃）,湿度（50±5%）,风力2级。实验第4,5天早上先以生理盐水灌胃,10ml/kg,再游泳加吹风;（3）葛根素片联合天麻素片组:其余处理同风热证偏头痛模型组,灌胃药为天麻素及葛根素（天麻素30mg/kg+葛根素150mg/kg）,灌胃量10ml/kg;（4）天麻素片组:其余处理同风热证偏头痛模型组,灌胃药为天麻素（30mg/kg）;（5）葛根素片组:其余处理同风热证偏头痛模型组,灌胃药为葛根素（150mg/kg）;（6）舒马普坦组:其余处理同风热证偏头痛模型组,灌胃药为舒马普坦（6mg/kg）。实验第6天,灌胃后对照组颈背部注射生理盐水2ml/kg,其余各组颈背部注射硝酸甘油2ml/kg。4小时后用鼠尾光照测痛仪测量各组大鼠痛阈,每组取5只灌注固定取脑,冰冻切片免疫组化方法检测大鼠脑片CGRP含量;每组另5只直接取丘脑、三叉神经节、三叉神经脊束核,在液氮中速冻,用Western-blot方法检测大鼠RAMP1及CRLR的含量。研究结果:1造模后观察大鼠行为学,发现风热证偏头痛模型组大鼠出现烦躁、笼内站立,眼结膜充血,舌红,大便无软便,质地偏干硬,挠头次数增多,双耳发红,爬笼次数增多等行为学表现。2痛阈:造模后模型组大鼠较空白对照组大鼠痛阈值明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）,与模型组比较,天麻素片组及葛根素片组单用组镇痛效果不明显,但葛根素片联合天麻素片组效果较好（P＜0.01）,与舒马普坦组效果相当;3免疫组化:各组脑片CGRP蛋白含量变化结果显示,风热证偏头痛模型组杏仁区CGRP蛋白含量较空白对照组显著升高（P＜0.01）;各治疗组均较模型组有降低趋势（P＜0.05）,联合用药组比天麻素片组及葛根素片组单用组降低更为明显（P＜0.05）;效果和西药舒马普坦组相当,两者无统计学差异;4 Western-blot:在丘脑部位,风热证偏头痛模型组较正常组CRLR明显增多,有统计学差异（P＜0.01）,RAMP1蛋白表达无显著统计学差异（p=0.078）,但表达有明显的增多趋势;与模型组相比,天麻素片组、葛根素片组RAMP1及CRLR均无明显的统计学差异;与模型组相比,联合用药组CRLR明显下降（P＜0.01）,RAMP1也有下降的趋势（p=0.09）;联合用药组RAMP1和CRLR表达量均低于葛根素片组（p＜0.05）;三叉神经节部位,风热证偏头痛模型组较空白对照组,RAMP1及CRLR含量均明显升高（p＜0.01）;与模型组比较,葛根素片联合天麻素片组RAMP1及CRLR含量均有所降低,其中,RAMP1更为显著（p＜0.01）;与模型组比较,舒马普坦组RAMP1及CRLR含量也有均有下降（p＜0.05）;联合用药组RAMP1蛋白表达含量均低于单用的天麻素片组、葛根素片组（p＜0.05）;在三叉神经脊束核部位,各组间差异不显著,但仍有趋势。风热证偏头痛模型组较空白对照组RAMP1（p=0.09）及CRLR（p=0.055）蛋白的表达均有所增加;与模型组相比,各治疗组RAMP1及CRLR蛋白含量均有下降;联合用药组比天麻素片组、葛根素片组下降趋势更明显。研究结论:“风邪”是导致偏头痛的重要病因,风热证是偏头痛的临床高发证型,偏头痛发生的一个重要条件即体虚之人调适不当所致,本实验以常温游泳加吹热风模拟风热证气候特征,以经典的硝酸甘油诱导偏头痛病理改变,病证结合造风热证偏头痛模型。造模结果显示,模型组大鼠出现舌红、烦躁、便干等类似人体风热症状以及搔头、爬笼等偏头痛样表现,风热证偏头痛大鼠模型造模结果与预期较为相符。CGRP是偏头痛发病机制的核心参与者,其释放增加被看作是三叉神经血管反射激活引起偏头痛发作的重要标志,CRLR与RAMP1的联合表达组成CGRP功能性受体。本实验以CGRP及其受体RAMP1、CRLR作为评价风热证偏头痛模型的造模效果以及中药对其干预。免疫组化结果发现,CGRP阳性表达以杏仁核区最为明显,提示CGRP可以在杏仁核区域促进疼痛作用,表明杏仁核不仅参与情绪的调控,还涉及疼痛和疼痛情绪的调节;Westren-blot结果发现,丘脑、三叉神经节、三叉神经脊束核部位RAMP1和CRLR蛋白的表达均有一定的相关性。葛根解肌祛风散热,主祛外风,天麻平肝熄风,主祛内风,两者配伍,从内外荡风邪。本实验将葛根素片与天麻素片联用,结果显示,联合用药能明显升高风热证偏头痛模型组大鼠痛阈,对偏头痛大鼠具有显著的镇痛作用;能显著降低风热证偏头痛模型组大鼠脑片杏仁核区CGRP含量的表达,效果优于单用;且比单用更能降低丘脑、三叉神经节、三叉神经脊束核部位CGRP受体RAMP1、CRLR蛋白含量的表达,其中,三叉神经节部位差异最为明显。因此,游泳吹风加颈背部注射硝酸甘油能有效诱导大鼠风热证偏头痛模型行为学特征,葛根素片联合天麻素片对该模型大鼠具有明显的镇痛作用,并能通过调节CGRP及其受体RAMP1、CRLR的表达参与抗偏头痛作用。